Гибридизация соматических клеток реферат

Обновлено: 04.07.2024

Цель: Целью данной работы является изучение генной и клеточной инженерии и ее значение в селекции растений, а также соматическую гибридизацию отдаленных видов растений.

Задачи: Задачей данной работы является понять и установить на основе примеров каким образом применяют генную и клеточную инженерию для получение новых устойчивых видов сельскохозяйственных растений.

Содержание

Введение
2
1
Генетическая инженерия на уровне клеток. Соматическая гибридизация отдаленных видов растений
3
2
Генная инженерия
5
3
Практическое применение генной инженерии растений с использованием Ti – плазмид
9

Список использованной литературы

Прикрепленные файлы: 1 файл

селекция 2.docx

Генетическая инженерия на уровне клеток. Соматическая гибридизация отдаленных видов растений

Практическое применение генной инженерии растений с использованием Ti – плазмид

Список использованной литературы

Бурное развитие новых методов исследований в генетике, расширение и углубление наших представлений о структуре и законах организации наследственного аппарата клетки обусловили создание и разработку принципиально новых методов. Раньше генетическое разнообразие форм растений и животных – исходного материала для селекции – экспериментально создавалось в селекции методами гибридизации, полиплоидии, мутагенеза и др. Теперь ученые могут достигать еще большего разнообразия благодаря манипулированию отдельными клетками живого организма, и отдельными генами. Родились новые понятия и направления современной генетики как: клеточная и генная инженерия. При этом принципиальное отличие данных методов от традиционно используемых в селекции, например мутагенеза, состоит в целенаправленном, а не случайном расширении границ изменчивости генотипа, в планируемом разнообразии исходного материала для селекции.

Клеточная инженерия – это использование комплекса генетических, клеточных или молекулярно-генетических методов при создании организмов с нужными человеку свойствами. В том случае, когда манипуляции осуществляют на уровне отдельных генов или их фрагментов, говорят о генной инженерии.

В зависимости от целей исследования работу ведут на следующих уровнях приложения биотехнологических и генетико-инженерных методов: 1) молекулярном, когда дело касается отдельных частей генов, 2) генном, 3) хромосомном, 4) плазмидном, 5) клеточном, 6) тканевом, 7) организменном, 8) популяционном.

1. Генетическая инженерия на уровне клеток. Соматическая гибридизация отдаленных видов растений

Начало клеточной инженерии относят к 1960-м гг. Развитие ряда новых методических приемов привело к расширению возможностей генетической инженерии на клеточном уровне. Определяющую роль сыграл метод гибридизации соматических клеток путем слияния изолированных протопластов (содержимого растительной клетки, освобожденной ферментативным путем от жесткой оболочки). Соматическую гибридизацию, т. е. получение гибридов без участия полового процесса, проводят, культивируя совместно клетки различных линий одного вида или клетки различных видов. При определённых условиях происходит слияние двух разных клеток в одну гибридную, содержащую оба генома объединившихся клеток. Такие протопласты от различных растений, в том числе и относящихся к разным видам, легко сливаются, объединяя в гибридной клетке генетическую информацию родительских форм. Например, можно получить слившиеся клетки ячменя и моркови, сои и кукурузы и т. д. Но такое слияние имеет смысл, только если оно приводит в результате к развитию полноценного организма. Затем из этой гибридной клетки можно вырастить целое растение. Данный метод позволяет создавать новые формы растений, не существующие в природе.

Получение протопластов клеток растений оказалось возможным путем обработки в гипертонической среде клеток мезофилла ферментами пектиназой и целлюлазой, действующими на соединительные ткани листа и клеточные оболочки. В этой среде протопласты представляют собой сферические образования зеленого цвета, отделенные от окружающей среды только цитоплазматической мембраной. Для обеспечения слияния протопластов растительных клеток в качестве индуктора используют нитрат натрия, полиэтиленгликоль и другие вещества. После слияния двух протопластов в единый протопласт появляется возможность клонирования целого растения с суммой признаков родительских форм. При слиянии клеток разных видов удается получать соматические, или парасексуальные, гибриды. Этот способ открывает большие перспективы для генетической инженерии растительных клеток, особенно для создания таких геномов, которые вследствие строгой половой несовместимости родительских растений нельзя получить генеративным путем.

Методика соматической гибридизации предусматривает последовательное осуществление следующих этапов:

1) препарирование в стерильных условиях нужной ткани;

2) приготовление суспензии клеток из ткани, например из мезофилла листа выбранных родительских растений;

3) ферментативное растворение оболочек клеток и получение оголенных протопластов;

4) стимуляции клеток;

5) обеспечение слияния ядер;

6) отбор слившихся гетерокарионтов;

7) обеспечение начала деления клеток;

8) регенерация гибридных растении.

Даже упрощенное изображение этого процесса ясно показывает сложность создания соматических гибридов. Тем не менее гибридные растения путем слияния соматических клеток уже на 1.01.1985 г. были получены в 104 случаях, из них 35 внутривидовых, 48 межвидовых, 9 межродовых, 12 межтрибных и 16 межсемейственных гибридов. С практической точки зрения наибольший интерес представляет соматическая гибридизация различных видов одного рода.

При гибридизации соматических клеток растений их предварительно освобождают от плотной клеточной оболочки, а затем проводят слияние изолированных протопластов. В этом случае, как и при гибридизации клеток животных, также удаётся преодолевать барьеры нескрещиваемости, которые существуют при обычной (половой) гибридизации растений разных видов и родов. Из гибридной растительной клетки на специальной среде можно вырастить клеточную массу – каллус, дифференцирующуюся в нормальное целое растение с корнями, стеблями и т. д. Такое гибридное растение можно высадить в землю и выращивать и размножать обычными способами. Эти методы, в отличие от традиционных, позволяют сравнительно легко и быстро получать достаточное количество генетически разнообразного исходного материала для селекции. Их применение привело, напр., к увеличению урожайности ряда культур – картофеля, цитрусовых и др.

Слияние протопластов открывает и другие возможности, более реальные на ближайшее время. Если основная доля генетической информации в клетке высших растений содержится в ядре, то часть ее, как известно, заключена в органеллах цитоплазмы: хлоропластах (обеспечивающих фотосинтез) и митохондриях (обусловливающих клеточное дыхание). Например, генетическая информация об устойчивости к гербицидам хранится в хлоропластах, а о мужской стерильности— в митохондриях. Мужская стерильность растений позволяет организовать массовое производство гибридных семян без кастрации материнских форм. В последние годы выявилась генетическая новизна соматических гибридов относительно сочетания ядерной и внехромосомной наследственности, они принципиально отличаются от половых: первые наследуют внеядерные гены от обоих родительских растений, вторые — только по материнской линии. Полагают, что при соматической гибридизации можно получить 12 жизнеспособных ядерно-цитоплазматических комбинаций, в то время как при половом процессе — только две.

Получение различных ядерно-цитоплазматических комбинаций открывает совершенно новые возможности для селекций. В качестве примера практического использования этого метода можно привести работы с рапсом в Национальном институте агрономических исследований Франции. Была поставлена задача получить растения рапса с мужской стерильностью. В первой серии опытов путем классической межвидовой гибридизации рапса и редиса получили мужскистерильные растения рапса, в клетках которых ядро происходило от рапса, а цитоплазма от редиса. Мужская стерильность таких растений обусловлена митохондриями редиса, что очень удачно с агрономической точки зрения. Однако из-за присутствия в клетках хлоропластов редиса данные растения желтеют и не имеют нектарников, которые очень важны для привлечения пчел - опылителей. Для устранения этих недостатков осуществили слияние протопластов стерильного рапса с протопластами нормального рапса, в результате чего сформировались растения с ядром и хлоропластами нормального рапса и лишь с митохондриями редиса в клетках. Такие растения сохранили мужскую стерильность, но уже не желтеют, а цветки их имеют нектарники. Полагают, что последнее связано с рекомбинацией митохондриальной ДНК.

Таким образом, с помощью соматической гибридизации можно получить многие отдаленные гибриды высших растений, чего нельзя добиться традиционными методами. С другой стороны, становится все более очевидным, что наибольшая результативность практической селекции зависит от разумного сочетания классических методов, возможности которых далеко не исчерпаны, с новыми методами генетической инженерии.

Параллельно с разработкой методов гибридизации соматических клеток определилось и другое направление — клонирование протопластов для использования в практической селекции. У некоторых видов (табак, томат, морковь и др.) возможно формирование целого растения из отдельного протопласта после регенерации клеточной оболочки и образования каллуса. За последние 7—8 лет в этом направлении получены обнадеживающие практические результаты. Протопласты могут быть хорошими реципиентами для введения чужеродной генетической информации и как исходный материал для соматической гибридизации.

2. Генная инженерия

А какова же все-таки роль генной инженерии в селекции растений? Ряд исследователей на основании накопленного в данной области опыта приходили к выводу, что в прикладных областях генная инженерия не даст чего-либо сверхзначительного. В то же время ее перспективность в решении некоторых конкретных вопросов бесспорна. Тем более, что с начала 80-х гг. введение в клетки растения чужеродных генов стало свершившимся фактом.

Для улучшения сортов нужный ген вводят в растительную клетку с помощью специальных векторов (рекомбинантных плазмид Agrobacterium tumefaciens или A. rhizogenes). Затем из трансформированной клетки методом культуры тканей регенерируют полноценное растение с новыми биологическими свойствами, дающее семена нового сорта. Здесь представлены генно-инженерные манипуляции с растениями при участии этих бактерий. Agrobacterium tumefaciens вызывает у растений рак. Бактерия содержит плазмиду Ti, сегмент которой (Т-ДНК) способен встраиваться в хромосомную ДНК растительной клетки. Инфекция индуцирует синтез соединений — опинов, которые служат бактерии пищей. Этот механизм инфекции используют для введения в растения чужеродных генов. Идея, проиллюстрированная на рисунке, сводится к включению нужного гена в сайт Т-ДНК и к трансформации клетки растения такой рекомбинантной плазмидой. Клетка должна регенерировать в полноценное растение, причем встроенный ген лишает Т-ДНК ее опухолевых свойств.

Используя данный метод, удалось выделить ген устойчивости к гербицидам, который был перенесен в клетки табака, чтобы попытаться регенерировать из них устойчивые растения. Группа исследователей из США трансформировала клетки подсолнечника геном фазеолина (резервного белка фасоли), который хорошо экспрессировался в регенерировавших растениях и передавался потомству. Другая группа ученых успешно пересадила ген одного из ферментов фотосинтеза (точнее, малой его субъединицы), который экспрессируется у полученного потомства.

Использование в качестве вектора рекомбинантной плазмиды бактерии Agrobacterium rhizogenes имеет некоторую специфику. Она обладает плазмидой Ri, в которой также содержится т-ДНК, способная встраиваться в хромосомную ДНК растительных клеток. В данном случае Т-ДНК вызывает обильное корнеобразование — синдром hairy-root. Эта Т-ДНК функциональна, поскольку трансформированные клетки корней синтезируют опины. Преимущества данного вектора (в сравнении с плазмидой Ti) состоят в том, что регенерация из корней представляется намного более простой и быстрой, чем из клеток раковой опухоли.

Первая группа – это вспомогательные технологии, которые не подменяют обычную селекцию, а служат ей. К ним можно отнести: оплодотворение in vitro (преодоление программной несовместимости), культивирование семяпочек и незрелых гибридных зародышей (преодоление постгамной несовместимости), получение гаплоидов путем культивирования пыльников и микроспор, криосохранение изолированных клеток, тканей и органов, клональное микроразмножение отдаленных гибридов.

Содержание работы

I.Введение…………………………………………………………. …. 2
II. Основная часть
1. Соматическая гибридизация высших растений…. ……4
2. Выделение протопластов…………………………………. 6
3. Слияние протопластов……………………………………. 9
4. Отбор и регенерация гибридных растений……………..11
III. Заключение……………………………………………………..……13
IV. Список литературы………..………………………………………..14

Файлы: 1 файл

биотехнология.docx

II. Основная часть

Соматическая гибридизация высш их растений…. ……4
Выделение протопластов…………………………………. 6
Слияние протопластов……………………………………. 9
Отбор и регенерация гибридных растений……………..11

Одно из направлений клеточных технологий – это использование их в селекции, которое облегчает и ускоряет традиционный селекционный процесс в создании новых форм и сортов растений. Существующие методы культивирования изолированных клеток и тканей in vitro условно можно разделить на две группы.

Вторая группа методов ведет к самостоятельному, независимому от традиционных методов селекции, получению новых форм и сортов растений: клеточная селекция с использованием каллусной ткани, соматическая гибридизация (слияние изолированных протопластов и получение неполовых гибридов), применение методов генной инженерии.

Cоматическая гибридизация –создание неполовых гибридов путем слияния изолированных протопластов, полученных из соматических клеток. Этот метод позволяет скрещивать филогенетически отдаленные виды растений, которые невозможно скрестить обычным половым путем, вызывать слияние трех и более родительских клеток, получать асимметричные гибриды, несущие весь генный набор одного из родителей наряду с несколькими хромосомами или генами, или только органеллами и цитоплазмой другого. Гибридизация соматических клеток дает возможность не только соединить в одном ядре гены далеких видов растений, но и сочетать в гибридной клетке цитоплазматические гены партнеров.

Соматическая гибридизация осуществляется через посредство слияния оголенных (безоболочковых) клеток, получаемых из лизофильных клеток листа или каллусных тканей.

Соматическая гибридизация по сравнению с половой имеет свои преимущества, которые заключаются в возможности скрещивания филогенетически отдаленных видов, получение ассиметричных гибридов, несущих весь генный набор одного из родителей наряду с несколькими хромосомами и цитоплазмой другого, возможности слияния трех и более клеток различных родителей, получении гетерозиготных по внеядерным генам.

Отличие соматической гибридизации от половой заключается и в принципиально ином наследовании ядерных и цитоплазматических генов. В результате слияния протопластов можно получить после регенерации растения с двуродительскими внеядерными генами. С помощью соматической гибридизации получены гибриды между табаком и картофелем, дикими и культурными видами картофеля, морковью и петрушкой, томатом и картофелем. В результате слияния протопластов кочанной капусты и редьки осуществлен перенос ЦМС в капусту.

Соматическая гибридизация высших растений

Под соматической гибридизацией понимается гибридизация между протопластами, выделенными из соматических клеток растений. Обычно для соматической гибридизации используют протопласты , полученные из мезофильных клеток листа или каллусных тканей. Термин "соматическая гибридизация" впервые предложен Г.Мельхерсом (1974). Для обозначения соматического гибрида используют вместо формулы Ах В, принятой для записи половой гибридизации, формулы А+В или А (х) В. Для обозначения гибрида , несущего гены ядра только одного из родителей, наряду с цитоплазматическими ( внеядерными) генами от обоих или только от другого родителя , используют термин " цитоплазматический гибрид" ("цибрид"). Гибриды, несущие альтернативные цитоплазматические гены от обоих родителей, называют "цитоплазматическими гетерозиготами" ("цитогетами").
Первое слияние протопластов было получено Пауэром и др. в 1970 году.

Соматическая гибридизация растений включает четыре отдельных этапа:
а)выделение протопластов
б)слияние протопластов
в) отбор и регенерация растений
г) анализ растений – регенерантов
Ю.Ю. Глеба, К.Н.Сытник (1982,1984) отмечают, что соматическая гибридизация открывает перед исследователем возможность:
1) скрещивать филогенетически отдаленные виды растений ( организмов), которые невозможно скрестить половым путем;
2) получить асимметричные гибриды, несущие весь генный набор одного из родителей наряду с несколькими хромосомами ( или несколькими генами, или только органеллами и цитоплазмой) другого;
3) создать систему гибридизации, включающую одновременное слияние трех и более родительских клеток;
4) получить растения, гетерозиготные по внеядерным генам( генам пластид и митохондрий)
Принципиальные различия между половыми и соматическими гибридами заключаются в следующем. При половой гибридизации происходит слияние ядер материнского и отцовского организмов и цитоплазмы материнского организма. При соматической гибридизации возможно слияние как ядер , так и цитоплазм материнского и отцовского организмов. При этом имеет место совершенно иной тип наследования ядерных и цитоплазматических генов. Ядерные гены при соматической гибридизации наследуются как дву, так однородительски, тогда как при половой только двуродительски. Внеядерные гены при соматической гибридизации наследуются двуродительски, а при половой передаются обычно только по материнской линии.
В результате слияния протопластов можно получить после регенерации растения, создание которых невозможно половым путем:
1)растения, ядро которых происходит от одного родителя, а цитоплазма от другого (цибриды);
2)растения, гетерозиготные по внеядерным генам ( цитогеты):
3)растения, часть внеядерных генов которых происходит от одного родителя, а часть от другого.

Выделение протопластов. Изолированные протопласты представляют собой клетки, лишенные оболочки. Оболочка растительных клеток состоит главным образом из целлюлозы, гемицеллюлозы и пектиновых веществ. Для ее разрушения применяют ферментативные смеси на основе целлюлаз, гемицеллюлаз и пектиназ. Впервые изолирование протопластов из клеток высших растений с использованием ферментов было осуществлено Е. Кокингом.

В настоящее время технология получения протопластов отработана для ряда культурных растений: табак, перец, баклажан, картофель, томаты, соя, клевер люцерна морковь, рапс и др.

Растительные протопласты способны восстанавливать клеточную оболочку, в результате делений образовывать каллус и в результате регенерации формировать растения. Благодаря этой способности протопласты нашли широкое применение в биотехнологии при гибридизации соматических клеток, переносе субклеточных частиц, клеточной селекции и генетической инженерии.

Отсутствие клеточной оболочки облегчает проникновение в протопласт из окружающего раствора макромолекул ( белки, нуклеиновые кислоты) и частиц (клеточные органеллы, микроорганизмы.).

Получение протопластов, таким образом, позволяет переходить с организменного уровня на клеточный и обратно, манипулировать содержанием растительной клетки, изменяя ее генетический аппарат.

Исходным материалом для выделения протопластов могут быть различные части растений листья, корни, семядоли, гипокотили, пыльцевые зерна, каллусные и суспензионные культуры. Оптимальные условия для выделения протопластов индивидуальны для различных растений и типов тканей. Главными факторами являются состав ферментов, рН среды, выбор осмотического раствора, физиологическое состояние, возраст и условия выращивания исходного растения. Вероятность получения жизнеспособных протопластов увеличивается, если растения находятся в состоянии активного роста. Эксплант растения подвергается стерилизации. Ферментные растворы лучше готовить непосредственно перед опытом или за сутки до опыта. Стерилизацию ферментов раствора производят через бактериальные фильтры. Важным фактором для выделения жизнеспособных протопластов является подбор осмотического стабилизатора, в качестве которого обычно используют сахара (глюкоза, сахароза, ксилоза, сорбит, маннит ); а также ионные осмотики – растворы солей СаСl2 , Na2 HPO4 , KCl. Среда должна быть гипертоничной, чтобы протопласты находились в слегка плазмолизированном состоянии.

Для получения протопластов из суспензионной культуры ее предварительно осаждают центрифугированием или фильтрованием , затем переносят в ферментный раствор. Каллусные ткани, растущие на агаре , переносят в чашку с ферментным раствором с помощью скальпеля . В случае использования для получения протопластов каллуса и суспензионной культуры отпадает необходимость в стерилизации исходного материала. При использовании каллуса и суспензионной культуры лучшей является поздняя стадия логарифмического роста ( клеточные стенки легче разрушаются ферментами, протопласты наиболее жизнеспособны).

После обработки ферментным раствором и изоляции протопласты должны быть очищены от остатков ткани и отмыты от ферментов . Для этого содержимое чашки после инкубации в ферментном растворе фильтруют через воронку с нейлоновым фильтром в пустую колбочку. Затем полученную суспензию изолированных протопластов переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют. Подбирая растворы различной плотности , добиваются осаждения протопластов на дно пробирки или всплывания на поверхность раствора. Протопласты отбирают пипеткой и переносят в среду, содержащую осмотик, в которой их центрифугируют второй раз , отмывая от ферментного раствора. Отмывку обычно осуществляют дважды.

Для культивирования протопластов используют обычно метод платирования в агаре или метод жидких капель. Перед пересадкой протопласты промывают, суспендируют в определенном объеме среды для культивирования и подсчитывают количество клеток в образце с использованием камеры Фукса-Розенталя. Для определения жизнеспособности протопластов их окрашивают флуоресцеиндиацетатом (ФДА), после чего жизнеспособные протопласты узнают по зеленому свечению в ультрафиолетовом свете.

При платировании в агаре объем суспензии протопластов в жидкой питательной среде наливают в чашки Петри, добавляют равный объем той же среды, содержащей 1% агар-агара. Температура не должна превышать 45 оС Тщательно перемешивают и оставляют на 30 минут для застывания агара. Плотность культивирования протопластов 104-105/мл. Чашки Петри запечатывают парафилмом и хранят перевернутыми в термостатируемой комнате для культивирования. Протопласты фиксируются на крышке чашки Петри, что дает возможность наблюдать развитие каждого протопласта.

При культивировании в висячей/сидячей капле протопласты с помощью автоматической пипетки распределяют по маленьким каплям (20-40 мкл) на крышке или на дне чашки Петри. Чашки запечатывают парафилмом и хранят при высокой влажности.

Для культивирования протопластов используют обычно среды Мурасиге-Скуга (1962); Нагата, Такебе (1971); Као, Михайлюка (1978). Оптимальные условия культивирования протопластов видо- и сортоспецифичны. Как правило, для инициации деления протопластов света не требуется, однако некоторые из них обладают чувствительностью к свету. Температура в зависимости от культуры колеблется от 22 до 30 оС.

Протопласты табака (а) и томата (б) (Бричкова Г.Г., Богуш Н.А., Плюта А.В. Манешина Т.В., 2003)

Слияние протопластов. Методы выделения протопластов описаны нами ранее. Для слияния протопластов используют два основных подхода:
1. Использование полиэтиленгликоля (ПЭГ) в сочетании с высоким рН (9-11) среды и повышенным содержанием ионов кальция Са2+(100-300мМ). Полиэтиленгликоль выполняет роль индуктора слияния, который обеспечивает агглютинацию (слипание). Высокое значение рН и высокая концентрация ионов кальция необходимы для нейтрализации отрицательного поверхностного заряда, который имеют протопласты. В местах слипания происходит разрыв плазмалемм протопластов, приводящий к их слиянию. На этот процесс оказывают влияние, помимо внешних факторов, особенности тканевой принадлежности клеток. Легко сливаются меристемные и каллусные протопласты, менее эффективно сливаются сильно вакуолизированные клетки и клетки с развитыми хлоропластами ( например, мезофильные протопласты )
2. Электрослияние протопластов. В этом случае протопласты помещают в неоднородное переменное электрическое поле. В этих условиях протопласты образуют мостик из нескольких клеток между электродами. После пропускания единичных импульсов тока происходит слияние протопластов в результате разрыва их плазмалемм. Эффективность метода слияния протопластов определяют по частоте слившихся протопластов, частоте клеточных клонов, образовавшихся из гибридных клеток, а также частоте образования гибридных проростков. В результате слияния протопластов образуются гомокарионы- продукты слияния генетически идентичных клеток, и гетерокарионы –продукты слияния генетически неидентичных клеток. Какова судьба слившихся протопластов? Возможны следующие варианты (Першина, 2000):
- синхронное деление двух ядер без их слияния и образование в результате исходных делений двуядерных дочерних клеток;
- слияние ядер во время митотического деления и формирование в дальнейшем одноядерных гибридных дочерних клеток.
Стабильность ядерных и цитоплазматических носителей генетической информации зависит от степени филогенетического родства родителей. При филогенетической отдаленности в процессе последующего деления клеток может происходить элиминация хромосом одного из родителей с последующим однородительским наследованием генов. Степень элиминации может быть различной. При этом соматические гибриды, сохраняющие оба ядерных генома, называются симметрическими, а соматические гибриды, несущие хромосомы преимущественно одного родителя – асимметрическими. Элиминацию хромосом одного из видов можно индуцировать путем обработки протопластов этого вида радиацией или химическими агентами. Таким образом, при соматической гибридизации возникает источник генетической изменчивости в результате реконструкции ядерных геномов и переноса генов от одного родителя другому.
Так, в результате слияния протопластов культурного вида картофеля Solanum tuberosum и дикорастущего вида томата Lycopersiсon pimpinellifolium получены растения с реконструированным ядерным геномом картофеля и интрогрессией генов томата, контролирующих устойчивость к болезням.
Вторым источником генетической изменчивости при соматической гибридизации является сегрегация ( разделение между дочерними клетками) митохондрий и пластид, полученных от обоих родителей. Такая сегрегация происходит независимо от событий, происходящих в ядре, причем митохондрии сегрегируют независимо от пластид. Такое неменделевское расщепление по генам цитоплазмы обеспечивает варианты как однородительского, так и двуродительского их наследования и различные варианты сочетания органелл в цитоплазме дочерних клеток. Дополнительным источником изменчивости по цитоплазматическим генам является процесс рекомбинации генов митохондрий или пластид. Учитывая, что цитоплазматические гены во многом определяют продуктивность и устойчивость культурных растений, использование изменчивости по этим генам, создаваемой при соматической гибридизации – важный ресурс в селекции растений.
В целом следует отметить, что расширение возможного спектра изменчивости как по ядерным, так и по цитоплазматическим генам при соматической гибридизации в сравнении с половой, а также возможность вовлечения в гибридизацию филогенетически отдаленных видов создает перспективы для создания принципиально новых генотипов растений, несущих различные комбинации ядерных и цитоплазматических генов родителей.

Следующий метод клеточной селекции–создание неполовых гибридов путем слияния изолированных протопластов, полученных из соматических клеток. Этот метод позволяет скрещивать филогенетически отдаленные виды растений, которые невозможно скрестить обычным половым путем, вызывать слияние трех и более родительских клеток, получать асимметричные гибриды, несущие весь генный набор одного из родителей наряду с несколькими хромосомами или генами, или только органеллами и цитоплазмой другого. Гибридизация соматических клеток дает возможность не только соединить в одном ядре гены далеких видов растений, но и сочетать в гибридной клетке цитоплазматические гены партнеров.

Выделение, культивирование и слияние изолированных протопластов. Для применения методов соматической гибридизации необходима разработка соответствующих технологий получения протопластов, способных делиться и регенерировать растения. Выделение протопластов растительных клеток путем их плазмолизирования и механического разрушения клеточной стенки было осуществлено еще в конце прошлого века. Однако метод изолированных протопластов получил развитие лишь после того, как в 1960 г. И.К. Коккинг впервые осуществил ферментативное разрушение клеточной стенки и выделил голые протопласты.

В настоящее время продолжается разработка и совершенствование методов выделения и культивирования протопластов на искусственных питательных средах (рис. 1.15). Для культивирования протопластов применяют те же питательные среды, что и для культуры изолированных клеток и тканей. Отличительной чертой сред для протопластов является повышенное осмотическое давление на начальных этапах культивирования, которое обеспечивается высокой концентрацией маннита или СаС1₂.

В процессе культивирования изолированные протопласты регенерируют новую клеточную стенку и превращаются в клетки, способные делиться и давать начало образованию каллусной ткани. На формирование колоний протопластами влияет состав питательной среды. Дальнейшая задача – получение из каллусной ткани растений-реге-нерантов. Пока не удалось получить регенеранты из протопластов многих злаковых (пшеницы, ячменя). Однако успешно осуществляется регенерация из протопластов пасленовых (табак, картофель, томаты) и других культур.

Протопласты выделяют из каллусных, суспензионных клеток или из клеток листьев, меристем, стеблей. При выделении протопластов из листьев сначала удаляют эпидермис, лист нарезают на сегменты и затем подвергают энзиматической обработке пектиназой и целлюлозой (Приложение 2).

Слияние изолированных протопластов может происходить спонтанно, но довольно редко. Индуцированное слияние изолированных протопластов впервые было получено в лаборатории Коккинга в 1970 г. его сотрудниками Пауэром и др. В качестве индуктора они использовали нитрат натрия. Но этот метод оказался малоэффективным, и сейчас найдены другие фьюзогены (индукторы слияния). Наиболее эффективными из них оказались растворы с высоким рН (9–11) и высокой концентрацией ионов кальция (100–300 мМ). Протопласты предварительно агглютинируют с помощью концентрированных растворов полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1500–6000. У. Циммерман с сотрудниками. разработали физический метод слияния протопластов животных клеток, липосом, в котором в качестве индуктора использовались импульсы электрического тока.

Слияние протопластов приводит к образованию либо гибрида, либо цибрида (рис. 1.17). Цибридная клетка содержит цитоплазму обоих партнеров, а ядро – одного. Это возможно в том случае, если после слияния протопластов не происходит соединения ядер, и одно ядро дегенерирует. Образование цибрида возможно и в том случае, если один из протопластов лишен ядра или оно инактивировано путем облучения.

Цибридизация позволяет ввести цитоплазматические гены, несущие признаки ЦМС (цитоплазматической мужской стерильности), устойчивости к некоторым гербицидам и патогенам.

Первый неполовой межвидовой гибрид высших растений получен в 1972 г. путем слияния изолированных протопластов двух видов табака: Nicotiana glauca и N. Langsdorfii.

В настоящее время методом парасексуальной гибридизации получено большое число межвидовых, межсемейственных и межтрибных гибридов. Однако во многих случаях гибридные растения, полученные таким путем, в той или иной степени ненормальны. Примером может служить соматический гибрид между арабидопсисом и турнепсом, который является растением-монстром. Возникающие аномалии являются результатом хромосомной несбалансированности (Ю.Ю. Глеба, 1982).

Особый интерес представляют межцарственные клеточные гибриды, полученные от слияния протопластов растительных и животных клеток. Описаны гибриды между протопластами эритроцитов крысы и протопластами дрожжевых клеток, между протопластами моркови и человека, табака и человека и др.

При соматической гибридизации эксперимент строится аналогично опытам по генетике микроорганизмов. Иными словами, используются большие популяции клеток обоих родителей. При обработке смешанной суспензии протопластов фьюзогенами часть из них сливается друг с другом, но в суспензии остаются и неслившиеся протопласты. Все они, включая гибридные, вдальнейшем регенерируют клеточные стенки и переходят к делениям. Возникает задача – выделить из общей массы гибридные экземпляры. Селекция гибридов может применяться либо на клеточном уровне, либо на стадии регенерации и осуществляется несколькими методами.

Для идентификации гибридов могут служить пластиды. Например, при слиянии протопластов табака и моркови в качестве селективных маркеров использовались зеленые хлоропласты табака и красно-оранжевые хромопласты моркови.

Другим методом, позволяющим производить отбор гибридов, является генетическая комплементация. Этот метод был применен для обнаружения гибридов табака, при этом использовались хлорофиллдефектные мутации у родителей с последующей комплементацией в гибридных продуктах. Сочетание двух ядерных рецессивных мутаций у табака вызывает светоза-висимую хлорофилльную недостаточность. Растения, гомозиготные по любому из этих генов, выращиваемые при интенсивном освещении, обесцвечиваются и гибнут. После слияния и регенерации клеточные колонии пересаживают на среду, индуцирующую стеблевой органогенез, и культивируют на свету.

Под методом физиологической комплементации, который также используется для обнаружения соматических гибридов, подразумевают способность гибридных клеток жить и размножаться либо переходить к морфогенезу в условиях культуры, при которых родительские клетки этого делать не в состоянии, причем неспособность родительских клеток не связана с какой-нибудь определенной мутацией, а является нормальной физиологической реакцией клетки на физиологические условия. Например, половые гибриды между N. glauca и N. Langsdorfii имеют склонность к опухолеобразованию, а клетки гибридов в условиях in vitro способны расти и размножаться на питательных средах без гормонов. Гормононезависимость клеток гибрида и была положена в основу метода селекции. После индуцированного слияния протопластов из мезофилла листьев обоих видов табака клетки через некоторое время пересаживали на питательную среду, не содержащую фитогормонов, и отбирали колонии, способные расти в этих условиях. Существуют также другие методы селекции соматических гибридов: смешанная физиологогенетическая комплементация, физическое обогащение (метод основан на разделении протопластов при центрифугировании в связи с их различной плотностью), механическая изоляция.

Использование изолированных протопластов в селекции растений не ограничивается возможностью их индуцированного слияния и получения соматических гибридов. Изолированные протопласты способны поглощать из окружающей среды макромолекулы и органеллы, следовательно, в них можно вводить чужеродную информацию, не пересаживая ДНК или органеллы других клеток. Уже проведена успешная трансплантация изолированных ядер в протопласты петунии и табака. Вместе с тем поглощение протопластами чужеродных ядер не всегда ведет к образованию гибридов. Кроме ядер в изолированные протопласты удалось трансплантировать чужеродные хлоропласты. Из этих протопластов Карлсон получил растения-регенеранты, содержащие хлоропласты другого организма.

Однако работы по переносу чужеродных органелл и ДНК только начинают развиваться. В целом использование изолированных протопластов в генетической реконструкции клетки, как мы видим, открывает богатые перспективы перед клеточной селекцией.

1. Бутенко Р.Г. Культура клеток растений и биотехнология. – М.: Наука, 1986.

2. Катаева Н.В., Бутенко Р.Г. Клональное микроразмножение растений – М Наука, 1983.

3. Шевелуха B.C. Рост растений и его регуляция в онтогенезе. – М.: Колос, 1992.

4. Шевелуха В.С., Калашникова С.В., Дегтярев С.В. и др. Сельскохозяйственная биотехнология – М.: Высшая школа, 1998.

Методы увеличения частоты парасексуальной гибридизации протопластов растений. Характеристика трибов и амфиплоидов как видов соматических гибридов. Экспериментальное индуцирование морфогенеза стеблеподобных в культуре межсемейственных гибридов тератом.

Рубрика	Биология и естествознание
Вид	реферат
Язык	русский
Дата добавления	10.07.2010
Размер файла	21,7 K

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Федеральное агентство по здравоохранению vи социальному развитию РФ

Гоу ВПО "Самарский Государственный

Медицинский Университет Росздрава"

Кафедра фармацевтической технологии

Реферат по биотехнологии

Гибридизация протопластов растений

студентка 6 курса 64 группы

Шоколев Олег Михайлович

доктор фармацевтических наук, Первушкин С.В.

Содержание

1. Гибридизация протопластов растений
2. Виды соматических гибридов
Заключение
Список литературы

Изолированные протопласты, еще не образовавшие клеточной стенки, могут сливаться между собой.

Слияние протопластов - своеобразный метод гибридизации, так называемая парасексуальная, или соматическая гибридизация. В отличие от обычной, где сливаются половые клетки (гаметы), в качестве родительских при парасексуальной гибридизации используются диплоидные клетки растений.

Внеядерные генетические детерминанты у большинства высших растений наследуются в половом процессе строго одноядерно и матерински.

Техника парасексуальной гибридизации может позволить:

· скрещивание филогенетически отдаленных видов растений (организмов),

· получение асимметричных гибридов, несущих генный набор одного из родителей наряду с несколькими хромосомами, органеллами или цитоплазмой другого,

· слияние трех и более клеток,

· получение гибридов, представляющих сумму генотипов родителей,

· перевод мутаций в гетерозиготное состояние, что позволяет получать жизнеспособные формы при слиянии протопластов, поскольку мутагенез довольно часто дает дефектное по морфогенезу растение,

· получение растений, гетерозиготных по внеядерным генам и др.

1. Гибридизация протопластов растений

Парасексуальная гибридизация важна для анализа как ядерных генов, так и внеядерных геномов. Цитоплазматический геном кодирует ряд признаков - скорость фотосинтеза, устойчивость к патогенам, абиотическим факторам и т. д. Наличие косегрегация генов (признаки, контролирующие внеядерный геном, сегрегируют совместно) свидетельствует о физическом сцеплении генов.

Слияние бывает спонтанным (чаще у протопластов из молодых тканей или суспензионных культур) и индуцированным. Для стимуляции слияния протопластов предложен ряд методов, как физических, так и химических.

При физическом способе слияния протопластов, разработанном Г. Циммерманом с сотрудниками в 1981 году, протопласты помещают в камеру с неоднородным электрополем. На электродах образуются агрегаты из 2 - 3 протопластов, либо цепочки из 5 - 6 протопластов между электродами. Дополнительный единичный импульс постоянного тока приводит к образованию пор в сильно сжатых мембранах, происходит перетекание цитоплазмы, так как переменный ток удерживает протопласты вместе некоторое время, и протопласты в таких агрегатах сливаются. Затухающий ток приводит к возвращению сферической формы у слившихся протопластов.

В основе слияния лежит различное действие постоянного и переменного электрического тока на плазмалемму. Постоянное эклектическое поле сжимает мембраны, ведя к их локальному разрушению, а переменное электрополе вызывает латеральную диффузию белков мембраны, образуя свободные от гликопротеидов липидные области, где противоположные мембраны могут установить контакт.

Чаще для индукции слияния протопластов используют методику "ПЭГ - высокие значения рН - высокая концентрация Са 2+ ", которая дает до 50% слившихся протопластов (рН 9 - 11, концентрация Са 2+ 100 - 300 ммоль/л). В присутствии полиэтиленгликоля наблюдается сильная адгезия протопластов, после удаления полиэтиленгликоля и добавления кальция - их слияние. Предполагают, что рН и ионы кальция увеличивают текучесть мембран, что связано с их жидкостно-мозаичной структурой.

При слиянии протопластов различных растений, например, А и В, могут с равной вероятностью образовываться комбинации АА, ВВ и АВ.

Желаемый продукт слияния - АВ, поэтому разрабатываются способы увеличения частоты слияния именно такого типа и избирательного выделения только продукта слияния АВ.

Один из таких методов заключается в следующем. Поверхность протопласта обычно несет отрицательный заряд. Путем обработки ее фосфолипидом, несущим положительный заряд, можно временно придать поверхности протопласта положительный заряд. Если теперь протопласты А, имеющие положительный заряд, смешать с необработанными протопластами В, несущими отрицательный заряд, то будут в основном образовываться комбинации АВ в результате притяжения разноименных зарядов.

Разработаны также методы маркирования протопластов того или иного растения с помощью разных флуоресцентных красителей. Если обработать протопласты одного растения флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), а протопласты другого растения родаминизотиоцианатом (RITC), то можно, не изменяя активности клеток, пометить их желто-зеленой (FITC) или красной (RITC) флуоресценцией. Гибриды, образовавшиеся путем слияния разных типов клеток, будут иметь оба цвета флюоресценции - желто-зеленый и красный.

Судьба геномов (ядерного и цитоплазматического) после слияния протопластов может быть различной:

1. Ядерные генетические детерминанты наследуются как дву-, так и однородительски. В последнем случае ядра не сливаются и впоследствии сегрегируют в процессе клеточных делений.

2. Внеядерные генетические детерминанты наследуются двуродительски. При этом в межвидовых комбинациях прослеживается тенденция к соматическому выщеплению и элиминации одного из родительских цитоплазматических геномов.

3. Возникновение гибридных клеток и растений в результате слияния более чем двух родительских клеток.

2. Виды соматических гибридов

Впервые зрелый межвидовой гибрид, полученный в результате парасексуальной гибридизации протопластов 2 сортов табака (Nicotiana glauca, c 24 хромосомами и N.langsdorfii c 18 хромосомами), описан Карлсоном в 1972 г. Каллус амфиплоидного гибрида мог расти на безгормональной среде. Гибридное растение цвело.

С тех пор были получены жизнеспособные внутривидовые, межвидовые, межродовые гибриды.

Осуществлено слияние протопластов культурного картофеля сорта Приекульский ранний (Solanum tuberosum) с протопластами дикого картофеля (S. chacoense). Известно, что у дикого картофеля клубни очень мелкие. Вместе с тем, растение устойчиво ко многим заболеваниям. Картофель сорта Приекульский ранний образует крупные клубни, но растения этого сорта восприимчивы к болезням. Размеры протопластов у этих растений разные.

Соматические гибриды по форме листьев и кустов, размеру клубней занимали промежуточное положение между культурными и дикими растениями. Вместе с тем гибрид, полученный в результате соматической гибридизации, оказался устойчивым к вирусу "У", чем отличался от полового гибрида.

Первая попытка по созданию межродовых гибридов принадлежит Г. Мельхерсу, создавшему в 1978 году гибрид картофель + томат, так называемый томатофель. Гибрид был стерилен, морфологически аномален: толстые корни, отсутствие типичных столонов, махровые цветки.

Было еще несколько попыток получения таких гибридов, но все растения стерильны. Эти эксперименты показали ограниченность применения парасексуальной гибридизации для прикладной селекции.

Ю. Ю. Глебой с сотрудниками проводились многочисленные эксперименты по созданию межтрибных гибридов.

Триба - таксономическая единица между семейством и родом. Получены удачные гибриды между Arabidopsis и Brassica (турнепс) - Arabidobrassica. У гибридных линий индуцировали морфогенез корней и растения. Растения генетически и морфологически униформны, не цвели. На вид - уродливы, очень много тератомоподобных образований, похожих на цветки.

Была осуществлена гибридизация 2-х родов пасленовых Datura innoxia + Atropa belladonna. Удалось регенерировать растения. Во всех случаях выявлены хромосомы обоих родительских видов.

Амфиплоиды оказались неспособны к стеблевому морфогенезу, в линиях с полиплоидным и анеуплоидным наборами хромосом получали аномальные стебли. Регенерировавшие растения были стерильны, похожи на дурман, но содержали небольшое количество хромосом красавки.

В других экспериментах сливали протопласты красавки с каллусными клетками китайского табака. Получили 12 клонов. В клетках всех клонов обнаружили хромосомные типы обоих родителей, через год только у двух клонов происходила полная элиминация хромосом красавки.

Интересные эксперименты были проведены в этой же лаборатории по гибридизации хлорофиллдефектного табака с красавкой. После слияния получили 40 фотосинтезирующих колоний, из них 4 клеточных линии дали нормальные растения красавки, 4 - аномальные по морфологии гибриды табак + красавка, остальные - зеленые, иногда пестролистные растения, идентичные табаку, которые цвели, давали семена. Они содержали хромосомы табака и пластиды красавки. Это были первые фертильные межтрибные гибриды.

Первые работы по получению межсемейственных гибридов проведены К.Као и В.Веттером в 1976-77 гг. (соя + табак). Позднее в лаборатории Ю.Ю.Глебы провели аналогичные эксперименты пасленовые + бобовые и лилейные (горошек + табак и лук + табак). И.Ф.Каневскому удалось индуцировать морфогенез стеблеподобных тератом в культуре межсемейственных гибридов N.tabacum + Vicia faba.

Практически во всех случаях наблюдалась видоспецифичная элиминация хромосом одного из родителей. В культурах межсемейственных гибридов наблюдалось много многоядерных клеток, клеток с мини ядрами, в метафазах делений встречались гигантские хромосомы. Отмечена асинхронность в расхождении родительских хромосом в анафазе. Морфогенез у такого материала отмечен не был.

Для отдаленных гибридов характерно:

1. Относительная стабильность гибридного состояния, при котором не наблюдается полной элиминации генетического материала одного из родителей.

2. Генетические перестройки (реконструкция и частичная элиминация хромосом).

3. Генетическая разнокачественность клонов гибридных клеток.

4. Ограниченная морфогенетическая способность.

Изучение межцарственных гибридов клеток "животное + растение" показало, что на этапе слияния видоспецифичность не проявляется, поэтому можно слить даже животную и растительную клетки. На более поздних этапах онтогенеза эти различия сказываются, что было установлено в экспериментах по слиянию протопластов арабидопсиса и табака с лимфоцитами человека. При этом происходило слияние цитоплазмы, ядра не сливались.

Эдвард Коккинг параллельно проводил изучение ультраструктуры таких гибридов, работая с клетками амфибий и протопластами моркови. После объединения клеток ядра амфибии были окружены тонким слоем собственной цитоплазмы, но уже через 48 часов отмечалось полное смешивание цитоплазмы и регенерация клеточной стенки вокруг гетерокариона.

Заключение

Таким образом, слияние протопластов приводит либо к образованию гибрида, либо к образованию цибрида.

Соматический гибрид - продукт слияния и цитоплазмы, и ядра обоих протопластов.

Цибрид (цитоплазматический гибрид) - растение-регенерант, содержащее цитоплазму обоих родителей и ядро одного из них.

Цибриды получают, облучая перед слиянием один из протопластов ?-лучами для разрушения ядра. Скрининг таких клеток проводится по генам - маркерам ядерного и цитоплазматических (митохондриального и хлоропластного) геномов. Есть указания на рекомбинацию ДНК митохондрий и хлоропластов в гибридных клетках.

При слиянии могут образовываться и так называемые асимметричные гибриды - продукты слияния, имеющие полный хромосомный набор одного из партнеров и часть хромосом другого партнера. Такие гибриды часто возникают при слиянии клеток организмов, филогенетически удаленных друг от друга. В этом случае вследствие неправильных делений клетки, обусловленных некоординированным поведением двух разнородных наборов хромосом, в ряду поколений теряются частично или полностью хромосомы одного из родителей. Асимметричные гибриды бывают устойчивее, плодовитее и жизнеспособнее, чем симметричные, несущие полные наборы генов родительских клеток.

В целях асимметричной гибридизации возможна избирательная обработка клеток одного из родителей для разрушения части его хромосом. Возможен прицельный перенос в клетку нужной хромосомы.

Гибриды могут быть получены путем слияния трех и более родительских клеток. Из таких гибридных клеток могут выращены растения - регенеранты.

Список литературы

4) Биотехнология лекарственных средств / под ред. В.А. Быкова, М.В. Данилина.-М.: Медбиоэкономика, 1991.

Читайте также: