Біотехнологія гібридизації соматичних клітин реферат

Обновлено: 05.07.2024

Первая группа – это вспомогательные технологии, которые не подменяют обычную селекцию, а служат ей. К ним можно отнести: оплодотворение in vitro (преодоление программной несовместимости), культивирование семяпочек и незрелых гибридных зародышей (преодоление постгамной несовместимости), получение гаплоидов путем культивирования пыльников и микроспор, криосохранение изолированных клеток, тканей и органов, клональное микроразмножение отдаленных гибридов.

Содержание работы

I.Введение…………………………………………………………. …. 2
II. Основная часть
1. Соматическая гибридизация высших растений…. ……4
2. Выделение протопластов…………………………………. 6
3. Слияние протопластов……………………………………. 9
4. Отбор и регенерация гибридных растений……………..11
III. Заключение……………………………………………………..……13
IV. Список литературы………..………………………………………..14

Файлы: 1 файл

биотехнология.docx

II. Основная часть

Соматическая гибридизация высш их растений…. ……4
Выделение протопластов…………………………………. 6
Слияние протопластов……………………………………. 9
Отбор и регенерация гибридных растений……………..11

Одно из направлений клеточных технологий – это использование их в селекции, которое облегчает и ускоряет традиционный селекционный процесс в создании новых форм и сортов растений. Существующие методы культивирования изолированных клеток и тканей in vitro условно можно разделить на две группы.

Вторая группа методов ведет к самостоятельному, независимому от традиционных методов селекции, получению новых форм и сортов растений: клеточная селекция с использованием каллусной ткани, соматическая гибридизация (слияние изолированных протопластов и получение неполовых гибридов), применение методов генной инженерии.

Cоматическая гибридизация –создание неполовых гибридов путем слияния изолированных протопластов, полученных из соматических клеток. Этот метод позволяет скрещивать филогенетически отдаленные виды растений, которые невозможно скрестить обычным половым путем, вызывать слияние трех и более родительских клеток, получать асимметричные гибриды, несущие весь генный набор одного из родителей наряду с несколькими хромосомами или генами, или только органеллами и цитоплазмой другого. Гибридизация соматических клеток дает возможность не только соединить в одном ядре гены далеких видов растений, но и сочетать в гибридной клетке цитоплазматические гены партнеров.

Соматическая гибридизация осуществляется через посредство слияния оголенных (безоболочковых) клеток, получаемых из лизофильных клеток листа или каллусных тканей.

Соматическая гибридизация по сравнению с половой имеет свои преимущества, которые заключаются в возможности скрещивания филогенетически отдаленных видов, получение ассиметричных гибридов, несущих весь генный набор одного из родителей наряду с несколькими хромосомами и цитоплазмой другого, возможности слияния трех и более клеток различных родителей, получении гетерозиготных по внеядерным генам.

Отличие соматической гибридизации от половой заключается и в принципиально ином наследовании ядерных и цитоплазматических генов. В результате слияния протопластов можно получить после регенерации растения с двуродительскими внеядерными генами. С помощью соматической гибридизации получены гибриды между табаком и картофелем, дикими и культурными видами картофеля, морковью и петрушкой, томатом и картофелем. В результате слияния протопластов кочанной капусты и редьки осуществлен перенос ЦМС в капусту.

Соматическая гибридизация высших растений

Под соматической гибридизацией понимается гибридизация между протопластами, выделенными из соматических клеток растений. Обычно для соматической гибридизации используют протопласты , полученные из мезофильных клеток листа или каллусных тканей. Термин "соматическая гибридизация" впервые предложен Г.Мельхерсом (1974). Для обозначения соматического гибрида используют вместо формулы Ах В, принятой для записи половой гибридизации, формулы А+В или А (х) В. Для обозначения гибрида , несущего гены ядра только одного из родителей, наряду с цитоплазматическими ( внеядерными) генами от обоих или только от другого родителя , используют термин " цитоплазматический гибрид" ("цибрид"). Гибриды, несущие альтернативные цитоплазматические гены от обоих родителей, называют "цитоплазматическими гетерозиготами" ("цитогетами").
Первое слияние протопластов было получено Пауэром и др. в 1970 году.

Соматическая гибридизация растений включает четыре отдельных этапа:
а)выделение протопластов
б)слияние протопластов
в) отбор и регенерация растений
г) анализ растений – регенерантов
Ю.Ю. Глеба, К.Н.Сытник (1982,1984) отмечают, что соматическая гибридизация открывает перед исследователем возможность:
1) скрещивать филогенетически отдаленные виды растений ( организмов), которые невозможно скрестить половым путем;
2) получить асимметричные гибриды, несущие весь генный набор одного из родителей наряду с несколькими хромосомами ( или несколькими генами, или только органеллами и цитоплазмой) другого;
3) создать систему гибридизации, включающую одновременное слияние трех и более родительских клеток;
4) получить растения, гетерозиготные по внеядерным генам( генам пластид и митохондрий)
Принципиальные различия между половыми и соматическими гибридами заключаются в следующем. При половой гибридизации происходит слияние ядер материнского и отцовского организмов и цитоплазмы материнского организма. При соматической гибридизации возможно слияние как ядер , так и цитоплазм материнского и отцовского организмов. При этом имеет место совершенно иной тип наследования ядерных и цитоплазматических генов. Ядерные гены при соматической гибридизации наследуются как дву, так однородительски, тогда как при половой только двуродительски. Внеядерные гены при соматической гибридизации наследуются двуродительски, а при половой передаются обычно только по материнской линии.
В результате слияния протопластов можно получить после регенерации растения, создание которых невозможно половым путем:
1)растения, ядро которых происходит от одного родителя, а цитоплазма от другого (цибриды);
2)растения, гетерозиготные по внеядерным генам ( цитогеты):
3)растения, часть внеядерных генов которых происходит от одного родителя, а часть от другого.

Выделение протопластов. Изолированные протопласты представляют собой клетки, лишенные оболочки. Оболочка растительных клеток состоит главным образом из целлюлозы, гемицеллюлозы и пектиновых веществ. Для ее разрушения применяют ферментативные смеси на основе целлюлаз, гемицеллюлаз и пектиназ. Впервые изолирование протопластов из клеток высших растений с использованием ферментов было осуществлено Е. Кокингом.

В настоящее время технология получения протопластов отработана для ряда культурных растений: табак, перец, баклажан, картофель, томаты, соя, клевер люцерна морковь, рапс и др.

Растительные протопласты способны восстанавливать клеточную оболочку, в результате делений образовывать каллус и в результате регенерации формировать растения. Благодаря этой способности протопласты нашли широкое применение в биотехнологии при гибридизации соматических клеток, переносе субклеточных частиц, клеточной селекции и генетической инженерии.

Отсутствие клеточной оболочки облегчает проникновение в протопласт из окружающего раствора макромолекул ( белки, нуклеиновые кислоты) и частиц (клеточные органеллы, микроорганизмы.).

Получение протопластов, таким образом, позволяет переходить с организменного уровня на клеточный и обратно, манипулировать содержанием растительной клетки, изменяя ее генетический аппарат.

Исходным материалом для выделения протопластов могут быть различные части растений листья, корни, семядоли, гипокотили, пыльцевые зерна, каллусные и суспензионные культуры. Оптимальные условия для выделения протопластов индивидуальны для различных растений и типов тканей. Главными факторами являются состав ферментов, рН среды, выбор осмотического раствора, физиологическое состояние, возраст и условия выращивания исходного растения. Вероятность получения жизнеспособных протопластов увеличивается, если растения находятся в состоянии активного роста. Эксплант растения подвергается стерилизации. Ферментные растворы лучше готовить непосредственно перед опытом или за сутки до опыта. Стерилизацию ферментов раствора производят через бактериальные фильтры. Важным фактором для выделения жизнеспособных протопластов является подбор осмотического стабилизатора, в качестве которого обычно используют сахара (глюкоза, сахароза, ксилоза, сорбит, маннит ); а также ионные осмотики – растворы солей СаСl2 , Na2 HPO4 , KCl. Среда должна быть гипертоничной, чтобы протопласты находились в слегка плазмолизированном состоянии.

Для получения протопластов из суспензионной культуры ее предварительно осаждают центрифугированием или фильтрованием , затем переносят в ферментный раствор. Каллусные ткани, растущие на агаре , переносят в чашку с ферментным раствором с помощью скальпеля . В случае использования для получения протопластов каллуса и суспензионной культуры отпадает необходимость в стерилизации исходного материала. При использовании каллуса и суспензионной культуры лучшей является поздняя стадия логарифмического роста ( клеточные стенки легче разрушаются ферментами, протопласты наиболее жизнеспособны).

После обработки ферментным раствором и изоляции протопласты должны быть очищены от остатков ткани и отмыты от ферментов . Для этого содержимое чашки после инкубации в ферментном растворе фильтруют через воронку с нейлоновым фильтром в пустую колбочку. Затем полученную суспензию изолированных протопластов переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют. Подбирая растворы различной плотности , добиваются осаждения протопластов на дно пробирки или всплывания на поверхность раствора. Протопласты отбирают пипеткой и переносят в среду, содержащую осмотик, в которой их центрифугируют второй раз , отмывая от ферментного раствора. Отмывку обычно осуществляют дважды.

Для культивирования протопластов используют обычно метод платирования в агаре или метод жидких капель. Перед пересадкой протопласты промывают, суспендируют в определенном объеме среды для культивирования и подсчитывают количество клеток в образце с использованием камеры Фукса-Розенталя. Для определения жизнеспособности протопластов их окрашивают флуоресцеиндиацетатом (ФДА), после чего жизнеспособные протопласты узнают по зеленому свечению в ультрафиолетовом свете.

При платировании в агаре объем суспензии протопластов в жидкой питательной среде наливают в чашки Петри, добавляют равный объем той же среды, содержащей 1% агар-агара. Температура не должна превышать 45 оС Тщательно перемешивают и оставляют на 30 минут для застывания агара. Плотность культивирования протопластов 104-105/мл. Чашки Петри запечатывают парафилмом и хранят перевернутыми в термостатируемой комнате для культивирования. Протопласты фиксируются на крышке чашки Петри, что дает возможность наблюдать развитие каждого протопласта.

При культивировании в висячей/сидячей капле протопласты с помощью автоматической пипетки распределяют по маленьким каплям (20-40 мкл) на крышке или на дне чашки Петри. Чашки запечатывают парафилмом и хранят при высокой влажности.

Для культивирования протопластов используют обычно среды Мурасиге-Скуга (1962); Нагата, Такебе (1971); Као, Михайлюка (1978). Оптимальные условия культивирования протопластов видо- и сортоспецифичны. Как правило, для инициации деления протопластов света не требуется, однако некоторые из них обладают чувствительностью к свету. Температура в зависимости от культуры колеблется от 22 до 30 оС.

Протопласты табака (а) и томата (б) (Бричкова Г.Г., Богуш Н.А., Плюта А.В. Манешина Т.В., 2003)

Слияние протопластов. Методы выделения протопластов описаны нами ранее. Для слияния протопластов используют два основных подхода:
1. Использование полиэтиленгликоля (ПЭГ) в сочетании с высоким рН (9-11) среды и повышенным содержанием ионов кальция Са2+(100-300мМ). Полиэтиленгликоль выполняет роль индуктора слияния, который обеспечивает агглютинацию (слипание). Высокое значение рН и высокая концентрация ионов кальция необходимы для нейтрализации отрицательного поверхностного заряда, который имеют протопласты. В местах слипания происходит разрыв плазмалемм протопластов, приводящий к их слиянию. На этот процесс оказывают влияние, помимо внешних факторов, особенности тканевой принадлежности клеток. Легко сливаются меристемные и каллусные протопласты, менее эффективно сливаются сильно вакуолизированные клетки и клетки с развитыми хлоропластами ( например, мезофильные протопласты )
2. Электрослияние протопластов. В этом случае протопласты помещают в неоднородное переменное электрическое поле. В этих условиях протопласты образуют мостик из нескольких клеток между электродами. После пропускания единичных импульсов тока происходит слияние протопластов в результате разрыва их плазмалемм. Эффективность метода слияния протопластов определяют по частоте слившихся протопластов, частоте клеточных клонов, образовавшихся из гибридных клеток, а также частоте образования гибридных проростков. В результате слияния протопластов образуются гомокарионы- продукты слияния генетически идентичных клеток, и гетерокарионы –продукты слияния генетически неидентичных клеток. Какова судьба слившихся протопластов? Возможны следующие варианты (Першина, 2000):
- синхронное деление двух ядер без их слияния и образование в результате исходных делений двуядерных дочерних клеток;
- слияние ядер во время митотического деления и формирование в дальнейшем одноядерных гибридных дочерних клеток.
Стабильность ядерных и цитоплазматических носителей генетической информации зависит от степени филогенетического родства родителей. При филогенетической отдаленности в процессе последующего деления клеток может происходить элиминация хромосом одного из родителей с последующим однородительским наследованием генов. Степень элиминации может быть различной. При этом соматические гибриды, сохраняющие оба ядерных генома, называются симметрическими, а соматические гибриды, несущие хромосомы преимущественно одного родителя – асимметрическими. Элиминацию хромосом одного из видов можно индуцировать путем обработки протопластов этого вида радиацией или химическими агентами. Таким образом, при соматической гибридизации возникает источник генетической изменчивости в результате реконструкции ядерных геномов и переноса генов от одного родителя другому.
Так, в результате слияния протопластов культурного вида картофеля Solanum tuberosum и дикорастущего вида томата Lycopersiсon pimpinellifolium получены растения с реконструированным ядерным геномом картофеля и интрогрессией генов томата, контролирующих устойчивость к болезням.
Вторым источником генетической изменчивости при соматической гибридизации является сегрегация ( разделение между дочерними клетками) митохондрий и пластид, полученных от обоих родителей. Такая сегрегация происходит независимо от событий, происходящих в ядре, причем митохондрии сегрегируют независимо от пластид. Такое неменделевское расщепление по генам цитоплазмы обеспечивает варианты как однородительского, так и двуродительского их наследования и различные варианты сочетания органелл в цитоплазме дочерних клеток. Дополнительным источником изменчивости по цитоплазматическим генам является процесс рекомбинации генов митохондрий или пластид. Учитывая, что цитоплазматические гены во многом определяют продуктивность и устойчивость культурных растений, использование изменчивости по этим генам, создаваемой при соматической гибридизации – важный ресурс в селекции растений.
В целом следует отметить, что расширение возможного спектра изменчивости как по ядерным, так и по цитоплазматическим генам при соматической гибридизации в сравнении с половой, а также возможность вовлечения в гибридизацию филогенетически отдаленных видов создает перспективы для создания принципиально новых генотипов растений, несущих различные комбинации ядерных и цитоплазматических генов родителей.

Следующий метод клеточной селекции–создание неполовых гибридов путем слияния изолированных протопластов, полученных из соматических клеток. Этот метод позволяет скрещивать филогенетически отдаленные виды растений, которые невозможно скрестить обычным половым путем, вызывать слияние трех и более родительских клеток, получать асимметричные гибриды, несущие весь генный набор одного из родителей наряду с несколькими хромосомами или генами, или только органеллами и цитоплазмой другого. Гибридизация соматических клеток дает возможность не только соединить в одном ядре гены далеких видов растений, но и сочетать в гибридной клетке цитоплазматические гены партнеров.

Выделение, культивирование и слияние изолированных протопластов. Для применения методов соматической гибридизации необходима разработка соответствующих технологий получения протопластов, способных делиться и регенерировать растения. Выделение протопластов растительных клеток путем их плазмолизирования и механического разрушения клеточной стенки было осуществлено еще в конце прошлого века. Однако метод изолированных протопластов получил развитие лишь после того, как в 1960 г. И.К. Коккинг впервые осуществил ферментативное разрушение клеточной стенки и выделил голые протопласты.

В настоящее время продолжается разработка и совершенствование методов выделения и культивирования протопластов на искусственных питательных средах (рис. 1.15). Для культивирования протопластов применяют те же питательные среды, что и для культуры изолированных клеток и тканей. Отличительной чертой сред для протопластов является повышенное осмотическое давление на начальных этапах культивирования, которое обеспечивается высокой концентрацией маннита или СаС1₂.

В процессе культивирования изолированные протопласты регенерируют новую клеточную стенку и превращаются в клетки, способные делиться и давать начало образованию каллусной ткани. На формирование колоний протопластами влияет состав питательной среды. Дальнейшая задача – получение из каллусной ткани растений-реге-нерантов. Пока не удалось получить регенеранты из протопластов многих злаковых (пшеницы, ячменя). Однако успешно осуществляется регенерация из протопластов пасленовых (табак, картофель, томаты) и других культур.

Протопласты выделяют из каллусных, суспензионных клеток или из клеток листьев, меристем, стеблей. При выделении протопластов из листьев сначала удаляют эпидермис, лист нарезают на сегменты и затем подвергают энзиматической обработке пектиназой и целлюлозой (Приложение 2).

Слияние изолированных протопластов может происходить спонтанно, но довольно редко. Индуцированное слияние изолированных протопластов впервые было получено в лаборатории Коккинга в 1970 г. его сотрудниками Пауэром и др. В качестве индуктора они использовали нитрат натрия. Но этот метод оказался малоэффективным, и сейчас найдены другие фьюзогены (индукторы слияния). Наиболее эффективными из них оказались растворы с высоким рН (9–11) и высокой концентрацией ионов кальция (100–300 мМ). Протопласты предварительно агглютинируют с помощью концентрированных растворов полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1500–6000. У. Циммерман с сотрудниками. разработали физический метод слияния протопластов животных клеток, липосом, в котором в качестве индуктора использовались импульсы электрического тока.

Слияние протопластов приводит к образованию либо гибрида, либо цибрида (рис. 1.17). Цибридная клетка содержит цитоплазму обоих партнеров, а ядро – одного. Это возможно в том случае, если после слияния протопластов не происходит соединения ядер, и одно ядро дегенерирует. Образование цибрида возможно и в том случае, если один из протопластов лишен ядра или оно инактивировано путем облучения.

Цибридизация позволяет ввести цитоплазматические гены, несущие признаки ЦМС (цитоплазматической мужской стерильности), устойчивости к некоторым гербицидам и патогенам.

Первый неполовой межвидовой гибрид высших растений получен в 1972 г. путем слияния изолированных протопластов двух видов табака: Nicotiana glauca и N. Langsdorfii.

В настоящее время методом парасексуальной гибридизации получено большое число межвидовых, межсемейственных и межтрибных гибридов. Однако во многих случаях гибридные растения, полученные таким путем, в той или иной степени ненормальны. Примером может служить соматический гибрид между арабидопсисом и турнепсом, который является растением-монстром. Возникающие аномалии являются результатом хромосомной несбалансированности (Ю.Ю. Глеба, 1982).

Особый интерес представляют межцарственные клеточные гибриды, полученные от слияния протопластов растительных и животных клеток. Описаны гибриды между протопластами эритроцитов крысы и протопластами дрожжевых клеток, между протопластами моркови и человека, табака и человека и др.

При соматической гибридизации эксперимент строится аналогично опытам по генетике микроорганизмов. Иными словами, используются большие популяции клеток обоих родителей. При обработке смешанной суспензии протопластов фьюзогенами часть из них сливается друг с другом, но в суспензии остаются и неслившиеся протопласты. Все они, включая гибридные, вдальнейшем регенерируют клеточные стенки и переходят к делениям. Возникает задача – выделить из общей массы гибридные экземпляры. Селекция гибридов может применяться либо на клеточном уровне, либо на стадии регенерации и осуществляется несколькими методами.

Для идентификации гибридов могут служить пластиды. Например, при слиянии протопластов табака и моркови в качестве селективных маркеров использовались зеленые хлоропласты табака и красно-оранжевые хромопласты моркови.

Другим методом, позволяющим производить отбор гибридов, является генетическая комплементация. Этот метод был применен для обнаружения гибридов табака, при этом использовались хлорофиллдефектные мутации у родителей с последующей комплементацией в гибридных продуктах. Сочетание двух ядерных рецессивных мутаций у табака вызывает светоза-висимую хлорофилльную недостаточность. Растения, гомозиготные по любому из этих генов, выращиваемые при интенсивном освещении, обесцвечиваются и гибнут. После слияния и регенерации клеточные колонии пересаживают на среду, индуцирующую стеблевой органогенез, и культивируют на свету.

Под методом физиологической комплементации, который также используется для обнаружения соматических гибридов, подразумевают способность гибридных клеток жить и размножаться либо переходить к морфогенезу в условиях культуры, при которых родительские клетки этого делать не в состоянии, причем неспособность родительских клеток не связана с какой-нибудь определенной мутацией, а является нормальной физиологической реакцией клетки на физиологические условия. Например, половые гибриды между N. glauca и N. Langsdorfii имеют склонность к опухолеобразованию, а клетки гибридов в условиях in vitro способны расти и размножаться на питательных средах без гормонов. Гормононезависимость клеток гибрида и была положена в основу метода селекции. После индуцированного слияния протопластов из мезофилла листьев обоих видов табака клетки через некоторое время пересаживали на питательную среду, не содержащую фитогормонов, и отбирали колонии, способные расти в этих условиях. Существуют также другие методы селекции соматических гибридов: смешанная физиологогенетическая комплементация, физическое обогащение (метод основан на разделении протопластов при центрифугировании в связи с их различной плотностью), механическая изоляция.

Использование изолированных протопластов в селекции растений не ограничивается возможностью их индуцированного слияния и получения соматических гибридов. Изолированные протопласты способны поглощать из окружающей среды макромолекулы и органеллы, следовательно, в них можно вводить чужеродную информацию, не пересаживая ДНК или органеллы других клеток. Уже проведена успешная трансплантация изолированных ядер в протопласты петунии и табака. Вместе с тем поглощение протопластами чужеродных ядер не всегда ведет к образованию гибридов. Кроме ядер в изолированные протопласты удалось трансплантировать чужеродные хлоропласты. Из этих протопластов Карлсон получил растения-регенеранты, содержащие хлоропласты другого организма.

Однако работы по переносу чужеродных органелл и ДНК только начинают развиваться. В целом использование изолированных протопластов в генетической реконструкции клетки, как мы видим, открывает богатые перспективы перед клеточной селекцией.

1. Бутенко Р.Г. Культура клеток растений и биотехнология. – М.: Наука, 1986.

2. Катаева Н.В., Бутенко Р.Г. Клональное микроразмножение растений – М Наука, 1983.

3. Шевелуха B.C. Рост растений и его регуляция в онтогенезе. – М.: Колос, 1992.

4. Шевелуха В.С., Калашникова С.В., Дегтярев С.В. и др. Сельскохозяйственная биотехнология – М.: Высшая школа, 1998.

Рефераты и конспекты лекций по географии, физике, химии, истории, биологии. Универсальная подготовка к ЕГЭ, ГИА, ЗНО и ДПА!

Причиной установленного еще в прошлом веке факта многоядерности клеток как патологических (опухоли, участки с воспалением, образующихся при коровьей оспы и др.)., Так и нормальных (мышечные волокна) тканей могло

быть, с одной стороны, разделение ядер без одновременного деления клеток (например, формирование плазмодия слизистого гриба Physarium), с другой-слияния нескольких клеток (миобластов) и образование многоядерной клетки - мышечного волокна. Слияние происходит не только среди дифференцированных клеток в многоклеточных организмах, но и между клетками в культуре. Сливаться могут клетки различного типа, принадлежащих к тому же виду (например, мышиные фибробласты и мышиные лимфобласты), так и клетки животных разных видов (например, мышь / человек; хомяк / курка; комар / человек). В первом случае родительские клетки, сливаются, различаются между собой по морфологическим, биохимическим, иммунологическим или функциональными свойствами, а продукты слияния является внутривидовыми гибридами. Во втором случае образуются межвидовые гибриды, а исходные родительские клетки, от слияния которых эти гибриды появляются, прежде всего отличаются генотипически, а иногда и фенотипически. Многоядерные клетки (поликарионы), образующихся в результате слияния клеток двух разных типов (А и В), представлены тремя комбинациями - АА, ВВ и АВ. Поликарионы, содержащих ядра только одного клеточного типа (АА и ВВ), называются Рэндзю-Риони; поликарионы, в составе которых присутствуют ядра обоих родительских типов (АВ), относятся к гетерокарионы. Слияние в гетерокарионы ядер после слияния клеток является результатом возникновения клеточного гибрида (рис. 4.1). Овчинников Ю.А. (1982) нашел решение проблемы с помощью метода гибридизации соматических клеток. Гибридизация широко используется в генетике, биологии клетки, биологии развития, вирусологии, биологии опухолей и других отраслях биологической науки, а также на практике.

Метод получения и культивирования гибридных клеток может быть использован для решения практических вопросов здравоохранения, потому что за продуктами экспрессии хромосомы остались в геноме синкариона из родительской клетки человека, определяются признаки генетических наследственных заболеваний. С помощью метода гибридизации соматических клеток удается ре-активировать онкогенный вирус. При слиянии клеток-вирусоносителей с нормальными, но чувствительными к опухолевого вируса клетками в синкарионах, образовавшиеся наступает реактивация вируса, интенсивно размножается в количествах, достаточных для его обнаружения.

Этот методический прием используют для выявления в опухолевых клетках онкогенного вируса. Образование синкарио-нов, последующее изучение клеточных гибридов в культуре, а также при введении их суспензии животным и появление опухолей наблюдается не во всех случаях, дает необходимую информацию для выяснения механизмов возникновения рака. Например, решать вопрос о злокачественности или доброкачественности полученного из опухолевой и нормальной клеток синкариона возможно, очевидно, в зависимости от наличия или отсутствия в гибридной клетке определенных хромосом.

Антисыворотки со специфическими антителами, полученными обычными методами, широко и успешно использовались для идентификации, очистки или для разрушения определенных клеток, находящихся в окружении клеточных популяций, которые различаются между собой. Специфические антисыворотки использовались при изучении клеточных линий и факторов, участвующих в процессах пролиферации и дифференциации, а также для идентификации компонентов синапсов, которые представляют собой места межклеточного взаимодействия в нервной системе.

С помощью методик с использованием антисыворотки была установлена специфическая локализация калмодулином, клатрину и тубулина в синаптических участках, что позволило сформулировать более обоснованное мнение о функции этих молекул, участвующих в обеспечении жизнедеятельности всех клеток. Кроме того, с помощью антисывороток в местах нервно-мышечного соединения были обнаружены специфические для данного участка антигены, которые играют важную роль в функционировании этого синапса. Становится очевидной потенциальная возможность метода применения анти-сывороток для раскрытия механизмов дифференциации нерва и мышцы в этой специализированной области.

Антисыворотки оказались наиболее эффективными реагентами, а их применение дало возможность выявлять локализацию клеток, синтезирующих и содержат нейропептиды и непептидного медиаторы, а также ферменты, участвующие в их биосинтезе. Высокая чувствительность имуноцитохимичних методов позволила идентифицировать и определить локализацию более двух десятков медиаторов.

Участие многих органических молекул в регуляции специфических клеточных функций удалось установить также с помощью иммунологических исследований. Потенциальные возможности метода невозможно реализовать через недостатки, присущие антисироват-кам, полученным в результате иммунизации животных гетерогенными имуногенамы. Эффективность антисывороток уменьшается из-за наличия не только молекул, которые интересуют в данный момент исследователя, но и других антигенов. Так, есть основания полагать, что отдельная клетка иммунной системы, синтезирующей иммуноглобулин (Ig), и ее потомки воспроизводят только один вид антител. Это уникальное свойство иммунной системы была положена в основу при разработке метода по снижению гетерогенности стандартных антисывороток. Иммунизацию животных проводят гетерогенными или полиспецифичнимы антигенами. Однако в дальнейшем в культуре выращивают клоны отдельных синтезирующих иммуноглобулин клеток, продуцирующих отдельные моноспецифических или моноклональные антитела, свободные от примесей антител к посторонним антигенов. Идентификация клеток, образующих антитела, не имеет особой сложности касающийся размножения их в культуре, то, как было сказано ранее, это удается сделать в течение непродолжительного времени. Гибридные клетки, полученные слиянием опухолевых и секретируют-чих иммуноглобулин клеток иммунной системы - гибридомы, сочетают в себе способность к длительному размножению в культуре со способностью биосинтеза моноклональных антител. Впервые Гибро-дома были получены путем слияния антителообразующих клеток селезенки (спленоцитив) мыши, иммунизированного бараньими эритроцитами, с миеломной клеткой, у которых отсутствовала гіпоксантинфосфорибозилтрансфераза (фермент, участвующий в реакциях метаболизма пуринов). Чтобы увеличить вероятность слияния родительских клеток и повысить выход гибридом, как вспомогательное средство используют вирусы с агглютинирующие свойствами. Вирусные частицы накапливаются на поверхности родительских клеток, которые вступают в контакт, на поверхности контактирующих клеток появляется большое количество микроворсинок, что в местах соприкосновения сливаются, образуя цитоплазматические мостики. Зоны слияния постепенно расширяются, заполняя всю площадь мембраны в области клеточного контакта.

Köhler G., Milstein C. (1975), что первыми предложили способ получения гибридом, для слияния родительских клеток использовали вирус Сендай, который относится к группе вирусов па-рагрипу, инактивированного ультрафиолетовым излучением. Вместо вирусов используются липиды, ионы кальция в щелочном растворе (рН 10,5), фосфолипаза С. В последнее время нашел широкое применение полиэтиленгликоль. Такие вещества, как цитохалазином В, ингибиторы энергетического обмена, а также средства, вызывающие местную анестезию, наоборот, блокируют процесс слияния клеток.

Клетки селезенки, не приняли участия в образовании гибридом, через некоторое время погибали, потому что не были способны к пролиферации и выживания в культуре. Миеломные клетки, оставшиеся в культуре, под влиянием приложенного в среду Аминоптерин погибали, так как процесс синтеза пуринов de novo прекращался. Ги бридомни клеточные линии были жизнеспособными в культуре благодаря присутствию гена, кодирующего биосинтез фермента гипоксантин-фосфорибозилтрансферазы, при участии которого гипоксантин превращается в пуриновые нуклеотиды. Гены родительской миеломы обеспечивают гибридомной культуре постоянный раздел.

Линия гибридомных клеток, синтезирует антитела против бараньих эритроцитов, была идентифицирована методом их гемолиза. Кроме того, оказалось, что в популяции гибридомных клеток количество клонов, продуцирующих антитела против бараньих эритроцитов, в 100 раз превышало количество клонов в исходной родительской популяции спленоцитив (10% в гибридомных популяции против 0,01% в популяции спленоцитив). Этот пример указывает на способность стимулированных антигеном клеток обеспечивать получение функционально активных гибридов.

При гибридомной технологии подходящей является такая система отбора, при которой жизнедеятельном оставались только гетерокарионы. С этой целью подбираются исходные родительские клеточные линии, имеющие дефекты в генах, которые препятствуют их деления и роста. Одновременно вследствие взаимной комплементации гетерокарионы сохраняют способность к делению (Зенгбуш П.).

Как отмечает Овчинников Ю.А. (1982), гибриды является только одним из вариантов использования культуры клеток в биотехнологии. С помощью гибридомной биотехнологии возможна регуляция иммунного ответа за счет получения моноклональных антител заданной специфичности.

Моноклональные антитела являются тем видом биотехнологической продукции, которую с успехом используют как в научно-исследовательской работе, так и для удовлетворения потребностей производства. Монокль-нальные антитела применяются при проведении идентификации молекул, интересующих исследователя, для очистки нужных антигенов (для детального анализа их структуры и функций), для выяснения механизмов дифференциации клеток в онтогенезе и разделения различных типов клеток иммунной системы. Моноклональные антитела, секретируемые культурой гибридомных клеток, является высокоэффективным и высокочувствительным диагностическим препаратом. Они могут использоваться как профилактические и лечебные средства, а также для получения Иммуносорбент, ферментных препаратов, интерферонов, гормонов и других биологически активных веществ (можно использовать культуры животных и растительных клеток).

Разработка способов индукции слияния протопластов вместе с развитием экспериментальной техники культивирования клеток in vitro, дающей возможность получения изолированных протопластов, их культивирования и образования каллуса и в дальнейшем целого растения, сформировало новый очень интересный и перспективный метод гибридизации растений — парасексуальную, или соматическую, гибридизацию.

Сущность этого способа гибридизации заключается в том, что в качестве родительских используются не половые клетки (гаметы), а клетки тела (сомы) растений, из которых изолируют протопласты.

Соматическая гибридизация — это метод создания неполовых гибридов путем слияния изолированных протопластов, полученных из соматических клеток. Гибридизация соматических клеток дает возможность не только соединить в одном ядре гены далеких видов (родов, семейств) растений, между которыми невозможно половое скрещивание, но и сочетать в гибридной клетке цитоплазматические гены партнеров.

Для получения гибридных клеток растений приготавливают протопласты путем разрушения клеточных стенок соответствующими ферментами. Слияния протопластов добиваются обработкой их полиэтиленгликолем (ПЭГ) или другими химическими препаратами. ПЭГ способствует агрегации протопластов. Собственно слияние мембран происходит только тогда, когда суспензию отмывают от ПЭГ раствором с высоким рН и высоким содержанием Са 2+ , которые существенно увеличивают текучесть мембран до фазового разделения и слияния.

Другим способом получения соматических гибридов является электрослияние. Слияние, индуцируемое электрическими импульсами, можно объяснить следующим образом. Импульс короткой продолжительности вызывает диэлектрическое разрушение соприкасающихся мембран протопластов. Вокруг дырки возможен обмен липидными молекулами, образование липидных мостов, что в конце концов приводит к слиянию мембран. Это энергетически более выгодное состояние, чем существование двух поврежденных мембран. Процессы, сопровождающиеся обменом липидов, отражают особенности жидкой мозаичной структуры клеточной мембраны и могут быть связаны с ее текучестью.

В отличие от полового скрещивания, где имеет место передача цитоплазмы только от материнского организма, при соматической гибридизации в образовавшемся гибриде оба партнера имеют более или менее равный цитоплазматический статус. Слияние протопластов способствует объединению двух различных цитоплазм. В большинстве исследований слияние протопластов высших растений приводит к образованию либо гибрида, либо цибрида. Цибридное растение содержит цитоплазму обоих партнеров, ядро — одного. Образование растения с гибридной цитоплазмой и органеллами обоих партнеров, но содержащее в своих клетках ядро только одного вида, возможно в том случае, если после слияния протопластов не происходит соединения ядер и одно ядро дегенерирует.

Важным моментом в изучении индуцированного слияния двух неродственных протопластов является селективный маркер, используемый для идентификации продукта гетероплазматического слияния, так как эффект индуктора не специфичен и вызывает агрегацию и слияния протопластов как одного и того же вида, так и различных видов. Для идентификации гетероплазматического продукта могут служить пластиды. Например, в случае индуцируемого ПЭГ слияния протопластов сои и капусты гетерокарион получал хлоропласты от капусты и плотную цитоплазму и неокрашенные пластиды от протопластов сои.

При межродовом слиянии протопластов табака и моркови как селективные маркеры использовались зеленые хлоропласты табака и красные, содержащие антоциан, протопласты моркови. Четко различимы были продукты слияния при межвидовой гибридизации между протопластами двух видов Torenia. Протопласты Т. fournieri, содержащие антоциан, комбинировались с протопластами Т. baitlonii, содержащими только хромопласты или только хлоропласты. Кроме пластид могут быть использованы биохимические и генетические маркеры, такие, как изоферментный состав, структура нуклеиновых кислот, устойчивость к антибиотикам, число хромосом, кариотипы.

Основной недостаток метода соматической гибридизации — низкая частота регенерации соматических гибридов, особенно межвидовых и межродовых. В связи с этим соматическую гибридизацию широко применяют у видов с высоким регенерационным потенциалом in vitro, прежде всего семейств Пасленовые, Капустные, Сельдерейные, Лилейные.

С помощью соматической гибридизации между культурными растениями и дикими видами были получены: сорта картофеля, устойчивые к вирусным заболеваниям, фитофторозу, колорадскому жуку; томаты, устойчивые к вирусу табачной мозаики.

Впервые зрелый межвидовой гибрид, полученный в результате парасексуальной гибридизации протопластов 2 сортов табака (Nicotiana glauca c 24 хромосомами и N.langsdorfii c 18 хромосомами), описан Карлсоном в 1972 г. Каллус амфиплоидного гибрида мог расти на безгормональной среде. Гибридное растение цвело. С тех пор были получены жизнеспособные внутривидовые, межвидовые, межродовые гибриды.

Первая попытка по созданию межродовых гибридов принадлежит Г. Мельхерсу, создавшему в 1978 году гибрид картофель + томат, так называемый томатофель. Гибрид был стерилен, морфологически аномален: толстые корни, отсутствие типичных столонов, махровые цветки. Было еще несколько попыток получения таких гибридов, но все растения стерильны. Эти эксперименты показали ограниченность применения парасексуальной гибридизации для прикладной селекции. Японскими исследователями (Х. Кисака с соавт., 1997) путем электрослияния протопластов ячменя и риса был получен межродовой соматический гибрид.

Протопласты риса получали из суспензионной культуры, а протопласты ячменя были изолированы из молодых листьев. Часть полученных каллусов сформировали зеленые участки и побеги. Только один побег сформировал корни, и это растение было успешно перенесено в почву. По морфологии было близко к растениям риса. Цитологический анализ показал, что растение имело и маленькие хромосомы от риса, и большие от ячменя. Были проанализированы также митохондриальная и хлоропластная ДНК. Растение содержало новые последовательности и в митохондриальной, и в хлоропластной ДНК, которые не обнаруживались ни в одном из родителей.

Ю. Ю. Глебой с сотрудниками проводились многочисленные эксперименты по созданию межтрибных гибридов. Триба - таксономическая единица между семейством и родом. Получены удачные гибриды между арабидопсисом и турнепсом - арабинобрассика. У гибридных линий индуцировали морфогенез корней и растения. Растения были уродливы, имели очень много тератомоподобных образований, похожих на цветки.

Была осуществлена гибридизация 2-х родов пасленовых дурмана и красавки. Удалось регенерировать растения. Во всех случаях выявлены хромосомы обоих родительских видов. Регенерировавшие растения были стерильны, похожи на дурман, но содержали небольшое количество хромосом красавки.

В других экспериментах сливали протопласты красавки с каллусными клетками китайского табака. Получили 12 клонов. В клетках всех клонов обнаружили хромосомные типы обоих родителей, через год только у двух клонов происходила полная элиминация хромосом красавки.

Морковь + сныть: из образовавшейся каллусной ткани через полгода регенерировали аномальные растения. Одно из них цвело, но у цветка отсутствовали пыльники и пестик.

Интересные эксперименты были проведены в этой же лаборатории по гибридизации хлорофиллдефектного табака с красавкой. После слияния получили 40 фотосинтезирующих колоний, из них 4 клеточных линии дали нормальные растения красавки, 4 - аномальные по морфологии гибриды табак + красавка, остальные - зеленые, иногда пестролистные растения, идентичные табаку, которые цвели, давали семена. Они содержали хромосомы табака и пластиды красавки. Это были первые фертильные межтрибные гибриды.

Первые работы по получению межсемейственных гибридов проведены К.Као и В.Веттером в 1976-77 гг. (соя + табак). Позднее в лаборатории Ю.Ю.Глебы провели аналогичные эксперименты пасленовые + бобовые и лилейные (горошек + табак и лук + табак). И.Ф.Каневскому удалось индуцировать морфогенез стеблеподобных тератом в культуре межсемейственных гибридов N.tabacum + Vicia faba.

Практически во всех случаях наблюдалась видоспецифичная элиминация хромосом одного из родителей. В культурах межсемейственных гибридов наблюдалось много многоядерных клеток, клеток с мини ядрами, в метафазах делений встречались гигантские хромосомы. Отмечена асинхронность в расхождении родительских хромосом в анафазе. Морфогенез у такого материала отмечен не был.

Для отдаленных гибридов характерно:

1. Относительная стабильность гибридного состояния, при котором не наблюдается полной элиминации генетического материала одного из родителей.

2. Генетические перестройки (реконструкция и частичная элиминация хромосом).

3. Генетическая разнокачественность клонов гибридных клеток.

4. Ограниченная морфогенетическая способность.

Изучение межцарственных гибридов клеток "животное + растение" показало, что на этапе слияния видоспецифичность не проявляется, поэтому можно слить даже животную и растительную клетки. На более поздних этапах онтогенеза эти различия сказываются, что было установлено в экспериментах по слиянию протопластов арабидопсиса и табака с лимфоцитами человека. При этом происходило слияние цитоплазмы, ядра не сливались. Эдвард Коккинг параллельно проводил изучение ультраструктуры таких гибридов, работая с клетками амфибий и протопластами моркови. После объединения клеток ядра амфибии были окружены тонким слоем собственной цитоплазмы, но уже через 48 часов отмечалось полное смешивание цитоплазмы и регенерация клеточной стенки вокруг гетерокариона.

Клеточная технология и инженерия

Ключевые слова: клеточная технология и инженерия, клеточная инженерия, метод культуры клеток и тканей, тотипотентностъ, микроклоналъное размножение растений, соматическая гибридизация, гибридомы, моноклональные антитела, метод трансплантации ядер, клонирование.
Раздел ЕГЭ: 3.9. Биотехнология, ее направления. Клеточная и генная инженерия, клонирование…

Клеточной инженерией называют эксперименты с изолированными клетками организмов, которые позволяют конструировать клетки нового типа путём гибридизации и слияния клеточных структур (ядер, митохондрий, хлоропластов) для получения организмов с заданными свойствами. Предпосылкой к развитию клеточной инженерии стала клеточная технология, использующая методы выращивания клеток и тканей на питательных средах (in vitro).

Микроклональное размножение растений

Выращивание клеток и тканей на питательных средах получило название метода культуры клеток и тканей. Его создание связано с работами американского и французского учёных

Ф. Уайта и Р. Готре, проводившимися в начале XX в. Положительные результаты впервые были получены на моркови. Кусочек растительной ткани — эксплант — был выделен из корнеплода растения и помещён на питательную среду, содержащую минеральные соли, аминокислоты, гормоны и другие необходимые для роста и развития вещества. В результате митотического деления эксплант образовал однородную неспециализированную клеточную массу — каллус, клетки которого обладали тотипотентностью (от лат. totus — целый и potentia — сила) — способностью давать начало любому типу клеток. При разделении клеток и добавлении в питательную среду фитогормонов ауксинов и кининов, обеспечивающих рост и дифференцировку клеток, были получены небольшие по размеру растения-регенеранты, похожие на проростки. Эти растения отмыли от питательной среды и пересадили на поле, где они развились в полноценные экземпляры моркови.

Микроклональное размножение моркови

Таким образом, метод культуры клеток и тканей позволяет размножить какое-либо растение в искусственно созданных условиях, т. е. создать его клон. Главное преимущество микроклонального размножения растении по сравнению с семенным размножением состоит в том, что с его помощью можно за короткое время получить большое число генетически однородных особей, способных к быстрому росту, обладающих калиброванными качествами и не заражённых возбудителями болезней. В настоящее время в некоторых европейских странах, например Голландии и Финляндии, весь посадочный материал получают с помощью метода культуры клеток и тканей. В России существуют питомники микроклонального размножения овощных, плодовых и декоративных культур, в которых производят посадочный материал для выращивания картофеля, томатов, смородины, яблони, земляники, роз, гвоздик и др.

Соматическая гибридизация

Искусственное объединение целых клеток с образованием гибридных геномов называют соматической гибридизацией. С помощью метода клеточной технологии были созданы отдалённые гибриды соматических клеток не только растений, но и животных.

Путём соматической гибридизации клеток культурного картофеля (Solarium tuberosum) и дикого (Solarium chacoense) был выведен новый сорт, отличающийся необычайной мощностью куста и устойчивый к ряду заболеваний. Для гибридизации использовались протопласты клеток двух видов картофеля, лишённые клеточной стенки и имеющие только наружную плазматическую мембрану. Они выращивались на питательной среде, где и происходило их слияние с образованием гибридного каллуса и дальнейшее развитие из него соматического гибридного растения. Благодаря хозяйственно ценным признакам полученный соматический гибрид картофеля стал затем широко использоваться в практической селекции. Половой же гибрид этих двух видов картофеля такими признаками не обладает.

Гибридизация картофеля: 1 — родительская форма S. tuberosum; 2 — соматический гибрид; 3 — родительская форма S. chacoense; 4 — половой гибрид

Иные задачи стоят перед клеточной инженерией в отношении работы с животными клетками. Например, важным вопросом иммунологии является регуляция иммунного ответа организма на конкретный антиген. Его решение позволит преодолеть проблемы трансплантационного (при пересадке органов и тканей), противоопухолевого и противовирусного иммунитета. Разработка направления клеточной инженерии, связанного с созданием антител определённой специфичности, приближает решение этих проблем.

Для получения таких антител конструируют гибридомы (от лат. hybrida — помесь и ота — опухоль) — гибридные клетки, образованные из протопластов лимфоцитов селезёнки иммунизированных животных и раковых клеток. Гибридомы производят один вид антител — моноклональные антитела (свойство, характерное для лимфоцитов) и способны неограниченно размножаться (свойство раковых клеток). В 1975 г. немецкий и английский учёные Г. Кёллер и Ц. Милыитейн описали методику получения моноклональных антител от гибридомы В-лимфоцитов селезёнки мышей и опухолевых клеток мышиной плазмоцитомы (рис. 269). За эту работу они были удостоены Нобелевской премии.

В настоящее время получено большое разнообразие моноклональных антител (от разных гибридом). Их используют в медицине для нейтрализации дифтерийного и столбнячного токсинов, змеиных ядов, для распознавания антител и антигенов, а также биологически активных веществ (гормонов, ферментов), находящихся в крови, плазме и лимфе. Моноклональные антитела обладают преимуществом перед кровяными сыворотками, так как по специфичности действия служат идеальными реагентами на конкретный антиген. Введённые в организм моноклональные антитела блокируют антигены, поэтому их применяют с целью ранней диагностики онкологических заболеваний. Моноклональные антитела способны доставлять к клеткам опухоли радиоактивные вещества, позволяющие точно обнаружить её местонахождение в организме, а также лекарственные препараты, обеспечивающие разрушение опухоли.

Реконструкция яйцеклеток и клонирование животных

В 1952 г. американские учёные Р. Бриггс и Т. Кинг разработали хирургический метод трансплантации ядер эмбриональных клеток лягушки. Осуществляли такую трансплантацию с помощью микропипетки. Учёные установили, что если брать ядра из клеток зародыша на стадии бластулы, то примерно в 80 % случаях зародыши благополучно развиваются и превращаются в нормальных головастиков. Реконструированные таким способом яйцеклетки давали начало новому полноценному организму, причём его признаки полностью определялись генами, содержащимися в хромосомах пересаженных в яйцеклетки ядер.

Результатом этих работ стало открытие способности соматических ядер обеспечивать нормальное развитие яйцеклеток в зародыши. Эксперименты доказали, что наследственный материал соматических клеток способен сохраняться полноценным в функциональном отношении, а дифференцировка клеток является результатом активности и блокировки определённых генов. Методом трансплантации ядер соматических клеток в яйцеклетки получены клоны амфибий, рыб, мышей, кроликов, овец и др.

Развитие взрослой лягушки из реконструированной яйцеклетки

Уникален опыт по клонированию домашних овец. В 1997 г. была опубликована статья шотландского учёного Яна Уилмута, в которой сообщалось, что в результате использования донорского ядра клетки молочной железы овцы породы Финский дорсет было получено клональное животное — овца по кличке Долли. В эксперименте использовались не только эмбриональные клетки, но и фибробласты (клетки соединительной ткани) плода, а также клетки молочной железы взрослой овцы. Все три типа клеток принадлежали разным породам овец и имели одинаковое число хромосом — 54. Деление клеток всех трёх типов на определённой стадии останавливали и ядра клеток овцы-донора пересаживали в ооциты овцы-реципиента.

Читайте также: