Заполните таблицу отметив основные виды микроскопии их разновидности кратко сформулируйте

Обновлено: 02.07.2024

Цель работы: изучить устройство светового биологического микроскопа и освоить правила работы с ним. Ознакомиться с различными видами микроскопии.

Материалы, реактивы, оборудование: микроскоп; бактериологические петли; предметные стекла.

1.1. Устройство микроскопа

Микроскоп (от греч. micros - малый и scopio - смотрю) - это оптический прибор, состоящий из двух частей: механической (подсобной) и оптической (главной).

1. Оптическая часть: окуляр, объектив, конденсор Аббе, осветительный прибор (зеркальце).

2. Механическая часть: штатив, основание, предметный столик, тубусодержатель, макровинт, микровинт (рис. 1).

Рис. 1. Устройство микроскопа: 1 - основание; 2 - осветитель; 3 - светофильтр; 4 - конденсор Аббе; 5 - предметный столик; 6 - объективы; 7 - револьверная головка;

8 - монокулярная насадка; 9 - окуляр; 10 - штатив; 11 - измерительный нониус; 12 - ограничительный винт; 13 - держатель препарата; 14 - ручка грубой настройки;

15 - ручка точной настройки; 16 - рукоятка перемещения конденсора


Механическая часть микроскопа.

Штатив имеет основание в виде подковы и колонку (тубусодержатель) в форме дуги. К нему примыкают коробка механизмов, система зубчатых колес для регуляции положения тубуса. Система приводится в движение вращением макрометрического и микрометрического винтов.

Макрометрический винт (кремальера, зубчатка, макровинт) служит для предварительной ориентировочной установки изображения рассматриваемого объекта.

Микрометрический винт (микровинт) используют для последующей четкой установки на фокус. При полном повороте микровинта труба передвигается на 0,1 мм (100 мкм).

При вращении винтов по часовой стрелке труба опускается по направлению к препарату, при вращении против часовой стрелки - поднимается от препарата.

Предметный столик служит для размещения на нем препарата с объектом исследования. Предметный столик вращается и перемещается во взаимно перпендикулярных плоскостях с помощью винтов. В центре столика находится круглое отверстие для освещения препарата снизу лучами света, направляемыми зеркалом микроскопа. В столик вмонтированы два зажима (клеммы) - пружинящие металлические пластинки, предназначенные для закрепления препарата.

Если необходимо исследовать поверхность препарата, не допуская пропусков (что важно при подсчете), или же если во время работы требуется повторное исследование какого-либо определенного участка на препарате, на предметный столик помещают препаратоводитель. На нем имеется система линеек - нониусов, с помощью которых можно присвоить координаты любой точке исследуемого объекта. Для этого при установке препаратоводителя следует совместить центр вращения столика и оптическую ось системы микроскопа с центрировочной пластинкой препаратоводителя (отсюда предметный столик с препаратоводителем называют иногда крестообразным).

Тубус (труба) - оправа, в которую заключены элементы оптической системы микроскопа. К нижней части тубуса прикрепляется револьвер (объективодержатель) с гнездами для объективов. Современные модели микроскопов имеют наклонный тубус с дугообразным тубусодержателем, что обеспечивает горизонтальное положение предметного столика.

Оптическая часть микроскопа состоит из основного оптического узла (объектив и окуляр) и вспомогательной осветительной системы (зеркало и конденсор). Все части оптической системы строго центрированы относительно друг друга.

Во многих современных микроскопах зеркало и конденсор заменены вмонтированным в прибор регулируемым источником света.

Осветительная система находится под предметным столиком. Зеркало отражает падающий на него свет в конденсор. Одна сторона зеркала плоская, другая - вогнутая. При работе с конденсором необходимо пользоваться только плоским зеркалом. Вогнутое зеркало применяют при работе без конденсора с объективами малых увеличений. Конденсор (от лат. con-denso - уплотняю, сгущаю), состоящий из 2-3 короткофокусных линз, собирает лучи, идущие от зеркала, и направляет их на объект. Конденсор необходим прежде всего при работе с иммерсионной системой. Линзы конденсора вмонтированы в металлическую оправу, соединенную с зубчатым механизмом, позволяющим перемещать конденсор вверх и вниз специальным винтом. Для регулировки интенсивности освещения в конденсоре есть ирисовая (лепестковая) диафрагма, состоящая из стальных серповидных пластинок.

Окрашенные препараты лучше рассматривать при почти полностью открытой диафрагме, неокрашенные - при уменьшенном отверстии диафрагмы.

Под конденсором располагается кольцевидный держатель для светофильтров (обычно к микроскопу прилагаются синее и белое матовые стекла). При работе с искусственным источником света светофильтры создают впечатление диезного освещения, что делает микроскопирование менее утомительным для глаз.

Объектив (от лат. objectum - предмет) - наиболее важная часть микроскопа. Это многолинзовая короткофокусная система, от качества которой зависит в основном изображение объекта. Наружная линза, обращенная плоской стороной к препарату, называется фронтальной. Именно она обеспечивает увеличение. Остальные линзы в системе объектива выполняют преимущественно функции коррекции оптических недостатков, возникающих при исследовании объектов.

Один из таких недостатков - явление сферической аберрации. Оно связано со свойством линз неравномерно преломлять периферические и центральные лучи. Первые обычно преломляются в большей степени, чем вторые, и поэтому пересекаются на более близком расстоянии к линзе. В результате изображение точки приобретает вид расплывчатого пятна.

Хроматическая аберрация возникает при прохождении через линзу пучка лучей с различной длиной волны. Преломляясь по- разному, лучи пересекаются не в одной точке. Сине-фиолетовые лучи с короткой длиной волны преломляются сильнее, чем красные с большей длиной волны. Вследствие этого у бесцветного объекта появляется окраска.

К объективам, устраняющим сферическую и частично хроматическую аберрацию, относятся ахроматы. Они содержат до 6 линз и коррегируют первичный спектр (желто-зеленую часть спектра), не устраняя вторичного спектра. Изображение, получаемое с помощью ахроматов, не окрашено, но края его имеют красный или синеватый ореол. В современных ахроматах этот недостаток практически неуловим. Лучший материал для линз ахроматов - флинтгласы - старые сорта стекла с высоким содержанием окиси свинца.

Объективы, устраняющие хроматическую аберрацию и для вторичного спектра, называют апохроматами. В их составе может быть от 1 до 12 линз. Линзы апохроматов для лучей коррекции вторичного спектра делают из плавикового пата, каменной соли, квасцов и других материалов. Апохроматы дают возможность устранить окрашивание объекта и получить одинаково резкое изображение от лучей разного цвета. Максимального эффекта при работе с апохроматами можно достичь только при их сочетании с компенсационными окулярами, возмещающими оптические недостатки объективов. В компенсационных окулярах хроматическая ошибка противоположна хроматической ошибке объектива, и в результате хроматическая аберрация микроскопа оказывается почти полностью компенсированной.

Планахроматы - разновидность апохроматов, имеющих плоское поле зрения. Объективы-планахроматы полностью устраняют искривление поля зрения, обуславливающее неравномерность фокусировки объекта (при кривизне поля зрения фокусируется только часть поля). Планахроматы и планапохроматы используют при микрофотографии.

Объективы бывают сухие и погружные (иммерсионные). При работе с сухими объективами между фронтальной линзой объектива и объектом исследования находится воздух. Оптический расчет иммерсионных объективов предусматривает их работу при погружении фронтальной линзы объектива в жидкую однородную среду. При работе с сухим объективом вследствие разницы между показателями преломления стекла (1,52) и воздуха (1,0) часть световых лучей отклоняется и не попадает в глаз наблюдателя (рис. 2).

Рис. 2. Ход лучей в сухой и иммерсионной системах: I-V- лучи света


При работе с иммерсионным объективом необходимо поместить между покровным стеклом и линзами объектива кедровое масло, показатель преломления которого близок к показателю преломления стекла (табл. 1).

Основными видами работы на лабораторных занятиях по гистологии являются самостоятельное микроскопирование и изучение гистологических препаратов. Анализируя структурные особенности гистологических объектов и характерные для них тинкториальные свойства, исследователь имеет возможность получить представление о функциональном состоянии изучаемых клеток, тканей и органов. Существенно дополняет эту информацию использование гистохимических методов и специальных микроскопических методов исследования. Успешное овладение микроскопической техникой и методами гистологического исследования создает условия для более глубокого изучения материала.

Цели занятия

  • Ознакомиться с содержанием основных этапов изготовления фиксированного и окрашенного гистологического препарата.
  • Получить представление о тинкториальных свойствах структур в гистологическом препарате.
  • Познакомиться с принципами работы и использования приборов специальной микроскопии в исследовательских целях.
  • Закрепить навыки микроскопирования гистологического препарата.

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ВНЕАУДИТОРНОЙ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЕ СТУДЕНТОВ

НЕОБХОДИМЫЙ ИСХОДНЫЙ УРОВЕНЬ ЗНАНИЙ

Из курса физики

  1. Основные оптические приборы, используемые для микроскопирования.
  2. Ход лучей в световом и электронном микроскопах.
  3. Разрешающая способность и увеличение микроскопа.

По теме занятия

  1. Методы исследования в гистологии.
  2. Окраска срезов и тинкториальные свойства гистологических структур.

ЛИТЕРАТУРА ДЛЯ САМОПОДГОТОВКИ

1. Быков В.Л. Цитология и общая гистология (функциональная морфология клеток и тканей человека). – СПб: СОТИС, 2004 или 2007 г. (с. 12 -30)

3. Гистология, эмбриология и цитология. под редакцией Улумбекова Э.Г., Челышева Ю.А. 3-е издание переработанное и дополненное. – М: ГЭОТАГ – Медицина, 2007 г. (с. 92 -101)

ЗАДАНИЯ

  1. Запишите в тетрадь требования, предъявляемые к гистологическому препарату (см. теор. блок)
  2. Отметьте в таблице названия основных этапов изготовления гистологического препарата и укажите кратко сущность каждого из них.

Этапы изготовления гистологического препарата Сущность этапа

  1. Заполните таблицу, перечислив основные группы красителей, укажите названия структур, воспринимающих краситель, и примеры красителей.
Группы красителей Название окрашиваемых структур Пример красителя
  1. Заполните таблицу, отметив основные виды микроскопии, их разновидности, кратко сформулируйте цели использования каждой разновидности.

Виды микроскопии Разновидности Цели использования

CИТУАЦИОННЫЕ ЗАДАЧИ

  1. На занятии студент рассматривает микропрепарат под микроскопом с увеличением объектива в 40 раз и окуляра в 15 раз. Во сколько раз видимое изображение структур больше истинного.
  2. При проведении хирургической операции возникла необходимость в гистологическом анализе оперируемого органа. Какие методы гистологического исследования следует при этом использовать?
  3. На лабораторном занятии по гистологии студент изучил микропрепарат при малом увеличении микроскопа, а затем хотел рассмотреть интересующую его структуру при большом увеличении, но, несмотря на попытки сфокусировать изображение, четкости он не добился, а стекло препарата разбилось. Какие ошибки были допущены при изучении микропрепарата?
  4. При изучении микропрепарата в световом микроскопе интересуемая структура находится у края поля зрения, справа. В какую сторону следует переместить микропрепарат на предметном столике микроскопа, чтобы она оказалась в центре поля зрения?

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОРОСЫ

Основные этапы развития астрономии. Гипотеза Лапласа: С точки зрения гипотезы Лапласа, это совершенно непонятно.

Микроскопия по своей сути представляет собой процесс изучения объектов с применением микроскопа. Этот направление также может подразделяться на несколько видов: электронная микроскопия, оптическая микроскопия, рентгеновская лазерная или рентгеновская микроскопия, которые отличаются особенностью применения специального электромагнитного излучения с вероятностью рассмотрения и получения полноценной картинки объекта, что напрямую зависит от разрешающей способности оптического оборудования (микроскопов).

Оптическая микроскопия

Человеческий глаз по большому счёту представляет собой природную оптическую систему. Она характеризуется наличием определённого разрешения, то есть самым небольшим расстоянием между элементами исследуемой картинки, что воспринимается как линии или точки. При этом они также могут друг от друга отличаться.

Для обычного человеческого глаза в условиях удаления от объекта на так называемое расстояние оптимального видения (D = 250 мм), нормальное среднестатистическое разрешение изображения составляет 0,176 миллиметров. Размеры большей части растительных и животных клеток, микроорганизмов и мелких кристаллов, сплавов и деталей микроструктуры металлов во много раз меньше этого значения. Для того чтоб наблюдать за подобными объектами, необходимы оптические приборы, в частности микроскопы самых разных типов. С их помощью можно беспрепятственно определить размеры, цвет и форму, строение и многие другие важные характеристики микроскопических объектов.

Световые или же оптические микроскопы используют для своей работы видимый свет, который проходит сквозь прозрачные объективы или же тот, что отражен от непрозрачных. Оптическая система, которая состоит из нескольких линз, позволяет получить необходимое увеличение картинки объекта. Полученное изображение можно исследовать глазом в микроскопе, или используя бинокуляр задействовать оба глаза. Благодаря новейшим технологиям информацию объект стало возможным фотографировать и передавать видео формат для оцифровки на видеокамеру. В состав современных микроскопов входят, как правило, системы подвески, наборы специальных окуляров и объективов, столик для перемещения предмета или препарата.

Учёными были специально разработаны такие виды микроскопов, которые позволяют значительно увеличить возможность рядовой оптической микроскопии:

  • Поляризационный микроскоп;
  • Люминесцентный микроскоп;
  • Металлографический микроскоп.

До 1950 – х годов многие учёные работали по большей части в диапазоне видимого спектра света. Человеческий глаз работает в оптическом диапазоне, ограниченном длиной волн. Оптические микроскопы не позволяли работать с разрешающей способностью меньше полупериода волны опорного излучения. Для видимого диапазона длина волны составляет 0,2—0,7 мкм, или 200—700 нм. Крайнее увеличение оптического микроскопа может составлять не более 2000 раз.

Большее увеличение картинки является бесполезным, так как оно не позволяет обнаружить какие – либо дополнительные особенности в структуре вещества или объекта. Некоторые отдельные частички с размером до 0,15 мкм довольно чётко видны при увеличении объекта в 2000 раз. Более мелкие частички не могут отражать световые лучи и по этой причине их нельзя заметить в оптический микроскоп.

Электронная микроскопия

Электронная микроскопия представляет собой совокупность специальных электронно–зондовых способов исследования микроструктуры твёрдых объектов, их электрических и магнитных микрополей, а также локальный состав. Для этого применяют электронные микроскопы – специальные приборы, в которых для того, чтоб получить качественное увеличение картинки применяют электронный пучок.

Метод электронной микроскопии включает в себя методики предварительной подготовки изучаемых объектов, а также обработку анализов всей результирующей информации. Принято различать два основных направления электронной микроскопии: растровая (сканирующая) и трансмиссионная (просвечивающая). Все они основаны на применении соответствующих типов.

Оба эти метода дают абсолютно новую качественную информацию относительно объекта исследования и довольно часто их используют совместно. Также известны такие типы электронной микроскопии как эмиссионная, отражательная, лоренцова, оже–электронная и прочие. Все они реализуются, как правило, с помощью специальных приставок к трансмиссионным и растровым электронным микроскопам.

Рентгеновская микроскопия

Рентгеновская микроскопия представляет собой некую совокупность способов изучения микроскопического строения и состава веществ и объектов с применением рентгеновского излучения. В рентгеновской микроскопии применяют специальные приборы, которые называются рентгеновские микроскопы. Их разрешающая способность может достигать 100 нм, что более чем в два раза больше, чем у обычных оптических микроскопов (200 нм).

Теоретически рентгеновская микроскопия может достичь в два раза высшего разрешения, чем оптическая, так как длина волны у рентгеновского излучения меньше на два порядка. Вместе с тем, современный оптический микроскоп – наноскоп обладает разрешением до 3 – 10 нм. Рентгеновскую микроскопию можно поделить на:

Для микробиологических исследований используют различные виды микроскопии: световую, люминесцентную, темнопольную, фазово-контрастную, электронную.

Наиболее распространенным методом является световая (оптическая) микроскопия.

В настоящее время отечественная промышленность выпускает самые разнообразные биологические микроскопы: МБИ-1, -2, -3, -4 (микроскоп биологический исследовательский), МБР (рабочий), люминесцентные микроскопы (МЛ-1, МЛ-2), электронные.

При микроскопировании изучают морфологию микроорганизмов, их тинкториальные свойства (отношение к красителям), а также структурные особенности (споры, капсулы), подвижность и др.

Микроскопия с фазово-контрастным устройством. С помощью фазово-контрастного устройства различия в фазе световых лучей при прохождении их через прозрачные объекты превращаются в амплитудные, в результате чего объекты становятся контрастными. Метод фазового контраста позволяет увидеть прозрачные объекты более четко (контрастно), но не увеличивает разрешающей способности микроскопа (рис.3). Основная ценность этого метода состоит в том, что он дает возможность наблюдать живые объекты без их фиксации и окрашивания.


Рис. 3. Фазово-контрастное устройство: А – общий вид; Б – принципиальная схема работы фазово-контрастного микроскопа


Рис. 4. Микроскопия в темном поле: А – внешний вид темнопольного конденсора ОИ-13; Б – принципиальная схема светового микроскопа с темнопольным конденсором

Микроскопия в темном поле. Микроскопия в темном поле основана на освещении объекта косыми лучами света (рис. 4). Лучи не попадают в объектив и остаются невидимыми для глаза, поэтому поле зрения выглядит совершенно черным. Если препарат содержит микроорганизмы, то косые лучи в определенной степени отражаются от их поверхности и, отклоняясь от своего первоначального направления, попадают в объектив. В этом случае на интенсивно черном поле видны ослепительно яркие светящиеся объекты. Такое освещение достигается применением специального темнопольного конденсора, имеющего затемненную среднюю часть. Поэтому центральные лучи света, идущие от зеркала, задерживаются, а в плоскость препарата попадают только боковые лучи, отраженные от зеркальных поверхностей, расположенных внутри конденсора.

При микроскопировании в темном поле можно увидеть объекты за пределами видимости обычного микроскопа. Однако наблюдение объектов в темном поле позволяет различить только их контуры и не дает возможности рассмотреть внутреннее строение.

Люминесцентная микроскопия. Люминесцентный микроскоп состоит из сильного источника ультрафиолетового света, светофильтров и биологического микроскопа (рис. 5) Между источником света и зеркалом микроскопа устанавливается сине-фиолетовый фильтр. Лучи света с короткой волной, попадая на препарат, возбуждают в нем свечение. На окуляр микроскопа ставят желтый фильтр, который отсекает сине-фиолетовые лучи и пропускает длинноволновые лучи, видимые глазом. В люминесцентной микроскопии большое значение имеет иммунофлюоресцентный метод с использованием специфических люминесцентных сывороток.


Рис. 5. Люминесцентный микроскоп МЛ-2:

Их приготовление основано на способности некоторых флюорохромов, например изоцианат флюоресцеина, вступать в химическую связь с сывороточными белками без нарушения их иммунологической специфичности.

При прямом иммунофлюоресцентном методе Кунса специфические антитела, связавшиеся с микробными антигенами, образуют комплексы, которые светятся при люминесцентной микроскопии препаратов. При непрямом методе вначале антиген обрабатывают гомологичными нефлюоресцирующими антителами, образуется комплекс антиген - антитело, для обнаружения которого применяют флюоресцирующую антивидовую сыворотку, соответствующую виду животного продуцента гомологичных антител. Антивидовые сыворотки получают, иммунизируя животных глобулинами животных тех видов, которые служат продуцентами антимикробных антител.

Электронная микроскопия. Электронная микроскопия делает возможным наблюдение объектов, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности светового микроскопа (0,2 мкм). Электронный микроскоп применяется для изучения вирусов, тонкого строения различных микроорганизмов, макромолекулярных структур и других субмикроскопических объектов.

В электронных микроскопах световые лучи заменяет поток электронов, имеющий при определенных ускорениях длину волны около 0,005 нм, т.е. почти в 100 000 раз короче длины волны видимого света. Высокая разрешающая способность электронного микроскопа, практически составляющая 0,1-0,2 нм, позволяет получить общее полезное увеличение до 1 000 000 раз (рис. 6).


Рис. 6. Электронный микроскоп: А — внешний вид; Б — принципиальная схема электронного микроскопа

Задания для самостоятельной работы

1. Изучить устройство микроскопа, освоить правила работы с ним.

2. Провести просмотр готовых окрашенных препаратов-мазков. Микроскопическую картину зарисовать.

3. В ходе работы уяснить значение конденсора, диафрагмы и других оптических частей микроскопа. С этой целью провести микроскопию: а) без конденсора и с опущенным конденсором с использованием объективов х8, х40, х90 и окуляров х7, х10, х15; б) с прикрытой диафрагмой.

Вопросы для самоподготовки и контроля знаний

1. Иммерсионный масляный объектив от других объективов отличается: А. Черной полосой.

Б. Белой полосой.

2. При микроскопии окрашенного препарата, приготовленного из культуры стафилококка, диаметр которого 1 мкм, получено изображение диаметром 0,9 мм. Определить, при каком сочетании объектива и окуляра проводилась микроскопия?

3. При микроскопии окрашенного препарата, приготовленного из культуры кишечной палочки, истинная длина которой 5 мкм, получено изображение палочки длиной около 4,5 мм.

Определить, при каком сочетании объектива и окуляра проводилась микроскопия?

4. При микроскопии препарата с объективом х90 и окуляром х10 получено нерезкое изображение.

Найти ошибку, которая была допущена при проведении микроскопии.

А. Конденсор не поднят до конца.

Б. Микроскопия проводится без масла.

В. Использовано вогнутое зеркало.

5. При микроскопии препарата с использованием объектива х90 и окуляра х10 выявлена слабая освещенность поля зрения.

Ваши действия по устранению этого недостатка:

А. Поднять конденсор до уровня предметного столика.

Б. Проверить и открыть диафрагму конденсора.

В. Нанести на препарат иммерсионное масло.

6. Размеры бактерии измеряются в микрометрах (мкм), один мкм составляет:

7. Структурные образования бактериальной клетки измеряются нанометрах (нм), один нм составляет:

8. Завершив микроскопию с использованием иммерсионной системы, необходимо сделать:

А. Поднять макровинтом тубус из масла и убрать препарат.

Б. Убрать препарат, поднять тубус микроскопа макровинтом.

9. После работы с микроскопом с использованием иммерсионной системы необходимо сделать:

А. Макровинтом поднять тубус, убрать препарат, салфеткой снять с объектива масло, поставить объектив х8, подложить салфетку под объектив, опустить тубус и конденсор.

Б. Убрать препарат, макровинтом поднять тубус, снять с объектива масло, поставить объектив х8, подложить салфетку под объектив, опустить тубус и конденсор.

В. Макровинтом поднять тубус, убрать препарат, поставить объектив х8, подложить салфетку под объектив, опустить тубус и конденсор.

10. При микроскопии препарата с иммерсионным объективом допущена ошибка, которая привела к получению нерезкого изображения. Найдите способ исправления ошибки.

А. Нанести на препарат иммерсионное масло.

Б. Вращать макровинт.

В. Вращать микровинт на полоборота в ту или иную сторону.

11. Установлено, что стафилококки при микроскопировании имеют диаметр, равный 1,35 мм, в действительности этот микроорганизм имеет диаметр, равный 1 мкм. Определите, при каком сочетании объектива и окуляра проводилась микроскопия?

А. Объектив х40, окуляр х15.

Б. Объектив х90, окуляр х7.

В. Объектив х90, окуляр х10.

Г. Объектив х90, окуляр х15.

12. Конденсор микроскопа предназначен для:

А. Уменьшения светового потока.

Б. Фокусирования световых лучей на плоскости рассматриваемого объекта.

В. Увеличения изображения объекта.

13. Микровинт микроскопа предназначен для:

А. Фокусировки при работе с объективом х40.

Б. Фокусировки при работе с объективом х90.

В. Перемещения препарата при микроскопии при работе с объективом х90.

14. При работе с микроскопом при увеличении х90 микровинт не вращается. Ваши действия по восстановлению работы микровинта:

А. Микровинт вращать в обратную сторону, добиваясь положения белой точки на середине между двумя белыми линиями.

Б. Поднять макровинтом объектив х90 из масла, вращая микровинт в обратную сторону, добиться положения белой точки на середине между двумя белыми линиями.

Читайте также: