Процесс производства инсулина кратко

Обновлено: 02.07.2024

Нарушение секреции инсулина. Использование аффиннойхромотографии. Схема получения инсулина. Экспрессия проинсулина в клетках Е.coli. Подходы к решению проблемы сахарного диабета. Вклад биотехнологии в промышленное производство непептидных гормонов.

Рубрика	Медицина
Вид	контрольная работа
Язык	русский
Дата добавления	11.12.2013
Размер файла	61,2 K

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН

КАЗАХСКИЙ АГРОТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ С.СЕЙФУЛЛИНА

Кафедра микробиологии и биотехнологии

На тему: Технология получения инсулина

Выполнила: Мырзабек М?лдір Курбанбек?ызы

Проверила: Акимбаева А.К (к. б. н.)

СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ

1. История открытия

2. Получение инсулина в биотехнологии

3. Способы получения инсулина человека

4. Экспрессия проинсулина в клетках Е.coli

5. Очистка инсулина

6. Способ применения и дозы

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

В данной курсовой работе применялись следующие определения:

Белок носитель - обеспечивающий транспортировку гибридного белка в периплазматическое пространство клетки или культуральную среду;

Аффинный компонент - существенно облегчающий выделение гибридного белка.

Инсулин (от лат. insula - остров) - гормон пептидной природы, образуется в бета-клетках островков Лангерганса поджелудочной железы.

Проинсулин - это предшественник инсулина, синтезирующийся В-клетками островкового аппарата поджелудочной железы.

Хроматография (от греч. chroma, chromatos - цвет, краска), физико-химический метод разделения и анализа смесей, основанный на распределении их компонентов между двумя фазами - неподвижной и подвижной (элюент), протекающей через неподвижную.

Инкапсуляция - механизм языка программирования, ограничивающий доступ к составляющим объект компонентам (методам и свойствам), делает их приватными, то есть доступными только внутри объекта.

Гибридный белок (англ. fusionprotein, также химерный, составной белок) - белок, полученный объединением двух или более генов, изначально кодировавших отдельные белки.

Гормоны (от греч. hormao - привожу в движение, побуждаю), инкреты, биологически активные вещества, вырабатываемые эндокринными железами, или железами внутренней секреции, и выделяемые ими непосредственно в кровь.

Сахарный диабет-группа эндокринных заболеваний, развивающихся вследствие абсолютной или относительной недостаточности гормона инсулина.

Соматостатин - гормон дельта-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы, а также один из гормонов гипоталамуса.

Радиоиммунный анализ - метод количественного определения биологически активных веществ, (гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и др.) в биологических жидкостях, основанный на конкурентном связывании искомых стабильных и аналогичных им меченных радионуклидом веществ со специфическими связывающими системами.

СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ

ВЭЖХ - высокоэффективной жидкостной хроматографией

кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота

Основная функция инсулина - обеспечивать проницаемость клеточных мембран для молекул глюкозы. В упрощенном виде можно сказать, что не только углеводы, но и любые питательные вещества, в конечном счете, расщепляются до глюкозы, которая и используется для синтеза других содержащих углерод молекул, и является единственным видом топлива для клеточных энергостанций - митохондрий. Без инсулина проницаемость клеточной мембраны для глюкозы падает в 20 раз, и клетки умирают от голода, а растворенный в крови избыток сахара отравляет организм.

Нарушение секреции инсулина вследствие деструкции бета-клеток - абсолютная недостаточность инсулина - является ключевым звеном патогенеза сахарного диабета 1-го типа. Нарушение действия инсулина на ткани - относительная инсулиновая недостаточность - имеет важное место в развитии сахарного диабета 2-го типа.

Использование аффиннойхромотографии значительно снизило содержание в препарате загрязняющих белков с более высокой м.м., чем у инсулина. К таким белкам относятся проинсулин и частично расщепленные проинсулины, которые способны индуцировать выработку антиинсулиновых антител.

Использование человеческого инсулина с самого начала терапии сводит к минимуму возникновение аллергических реакций. Человеческий инсулин быстрее абсорбируется и независимо от формы препарата имеет более короткую длительность действия, чем животные инсулины. Человеческие инсулины менее иммуногены, чем свиные, особенно смешанные бычьи и свиные инсулины.

Целью данной курсовой работы является изучить технологию получения инсулина. Для достижения были поставлены следующие задачи:

1.получение инсулина в биотехнологии

2. способы получения инсулина

З. очистка инсулина

1. История открытия

История открытия инсулина связана с именем русского врача И.М. Соболева (вторая половина 19 века), доказавшего, что уровень сахара в крови человека регулируется специальным гормоном поджелудочной железы.

После получения первой промышленной партии инсулина в последующие несколько лет пройден огромный путь его выделения и очистки. В результате гормон стал доступен для больных сахарным диабетом 1 типа.

В 1935 году датский исследователь Хагедорн оптимизировал действие инсулина в организме, предложив пролонгированный препарат.

Первые кристаллы инсулина были получены в 1952 году, а в в1954 году английский биохимик Г. Сенджер расшифровал структуру инсулина. Развитие методов очистки гормона от других гормональных веществ и продуктов деградации инсулина позволили получить гомогенный инсулин, называемый однокомпонентным.

В начале 70-х гг. советскими учеными А. Юдаевым и С. Швачкиным был предложен химический синтез инсулина, однако осуществление данного синтеза в промышленном масштабе было дорогостоящим и нерентабельным.

В дальнейшем шло прогрессирующее улучшение степени очистки инсулинов, что уменьшало проблемы, обусловленные инсулиновой аллергией, нарушениями работы почек, расстройством зрения и иммунной резистентностью к инсулину. Был необходим наиболее эффективный гормон для заместительной терапии при сахарном диабете - гомологичный инсулин, то есть инсулин человека.

В 80-годах достижения молекулярной биологии позволили синтезировать с помощью E.coli обе цепи человеческого инсулина, которые были, затем соединены в молекулу биологически активного гормона, а в Институте биоорганической химии РАН получен рекомбинантный инсулин с использованием генно-инженерных штаммов E.coli.

2. Получение инсулина в биотехнологии

Инсулин, пептидный гормон островков Лангерганса поджелудочной железы, представляет основное средство лечения при сахарном диабете. Эта болезнь вызвана дефицитом инсулина и проявляется повышением уровня глюкозы в крови. До недавнего времени инсулин получали из поджелудочной железы быка и свиньи. Препарат отличался от человеческого инсулина 1-3 аминокислотными заменами, так что возникала угроза аллергических реакций, особенно у детей. Широкомасштабное терапевтическое применение инсулина сдерживалось его высокой стоимостью и ограниченностью ресурсов. Путем химической модификации инсулин из животных удалось сделать неотличимым от человеческого, но это означало дополнительное удорожание продукта.[1]

К лечению диабета приложена также технология инкапсулирования: клетки поджелудочной железы в капсуле, введенные однократно в организм больного, продуцируют инсулин в течение года.

Компания Integrated Genetics приступила к выпуску фолли-кулостимулирующего и лютенизирующего гормонов. Эти пептиды составлены из двух субъединиц. На повестке дня вопрос о промышленном синтезе олигопептидных гормонов нервной системы -энкефалинов, построенных из 5 аминокислотных остатков, и эндорфинов, аналогов морфина. При рациональном применении эти пептиды снимают болевые ощущения, создают хорошее настроение, повышают работоспособность, концентрируют внимание, улучшают память, приводят в порядок режим сна и бодрствования. Примером успешного применения методов генетической инженерии может служить синтез р-эндорфина по технологии гибридных белков, описанной выше для другого пептидного гормона, соматостатина[2].

3. Способы получения инсулина человека

Исторически первым способом получения инсулина для терапевтических целей является выделение аналогов этого гормона из природных источников (островков поджелудочной железы крупного рогатого скота и свиней). В 20-х годах прошлого века было установлено, что бычий и свиной инсулины (которые являются наиболее близкими к инсулину человека по своему строению и аминокислотной последовательности) проявляют в организме человека активность, сравнимую с инсулином человека. После этого долгое время для лечения пациентов, страдающих сахарным диабетом I типа, применяли инсулины быка или свиньи. Однако через некоторое время было показано, что в ряде случаев в организме человека начинают накапливаться антитела к бычьему и свиному инсулинам, тем самым сводя на нет их действие.

С другой стороны, одним из преимуществ этого метода получения инсулина является доступность исходного сырья (бычий и свиной инсулин можно легко получать в больших количествах), что и сыграло решающую роль при разработке первого способа получения инсулина человека. Этот метод получил название полусинтетического[3].

При этом способе получения инсулина человека в качестве исходного сырья использовали свиной инсулин. От очищенного свиного инсулина отщепляли С-концевой октапептид В-цепи, после чего синтезировали С-концевой октапептид человеческого инсулина. Затем его химически присоединяли, снимали защитные группы и очищали полученный инсулин. При тестировании данного метода получения инсулина было показана полная идентичность полученного гормона инсулину человека. Основной недостаток данного способа заключается в высокой стоимости получающегося инсулина (даже сейчас химический синтез октапептида - дорогое удовольствие, тем более в промышленном масштабе).

В настоящее время инсулин человека, в основном, получают двумя способами:модификацией свиного инсулина синтетико-ферментативным методом и генно-инженерным способом.

В первом случае метод основан на том, что свиной инсулин отличается от инсулина человека одной заменой на С-конце В-цепи Ala30Thr. Замену аланина на треонин осуществляют путем катализируемого ферментом отщепления аланина и присоединение вместо него защищенного по карбоксильной группе остатка треонина, присутствующего в реакционной смеси в большом избытке. После отщепления защитной О-трет-бутильной группы получают инсулин человека. (рисунок 1)

Рисунок 1 - Схема способы получения инсулина человека

Инсулин оказался первым белком, полученным для коммерческих целей с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Существует два основных подхода для получения генно-инженерного инсулина человека. В первом случае осуществляют раздельное (разные штаммы-продуценты) получение обеих цепей с последующим фолдингом молекулы (образование дисульфидных мостиков) и разделением мизоформ. Во втором - получение в виде предшественника (проинсулина) с последующим ферментативным расщеплением трипсином и карбоксипептидазой. В до активной формы гормона. Наиболее предпочтительным в настоящее время является получение инсулина в виде предшественника, обеспечивающее правильность замыкания дисульфидных мостиков (в случае раздельного получения цепей проводят последовательные циклы денатурации, разделения мизоформ и ренатурации[3].

При обоих подходах возможно как индивидуальное получение исходных компонентов (А- и В-цепи или проинсулин), так и в составе гибридных белков. Помимо А- и В-цепи или проинсулина, в составе гибридных белков могут присутствовать:

1) белок носитель - обеспечивающий транспортировку гибридного белка в периплазматическое пространство клетки или культуральную среду;

2) аффинный компонент - существенно облегчающий выделение гибридного белка.

При этом оба эти компонента могут одновременно присутствовать в составе гибридного белка. Кроме этого, при создании гибридных белков может использоваться принцип мультимерности, (то есть, в гибридном белке присутствует несколько копий целевого полипептида), позволяющий существенно повысить выход целевого продукта[4].

4. Экспрессия проинсулина в клетках Е.coli

В работе использовали штамм JM 109 N1864 со встроенной в плазмиду нуклеотидной последовательностью, экспрессирующей гибридный белок, который состоит из линейного проинсулина и присоединенного к его N-концу через остаток метионина фрагмента белка АStaphylococcusaureus. Культивирование насыщенной биомассы клеток рекомбинантного штамма обеспечивает начало производства гибридного белка, выделение и последовательная трансформация которого intube приводят к инсулину. Другая группа исследователей получала в бактериальной системе экспрессии слитой рекомбинантный белок, состоящий из проинсулина человека и присоединенного к нему через остаток метионина полигистидинового "хвоста". Его выделяли, используя хелатную хроматографию на колонках с Ni-агарозой из телец включения и расщепляли бромцианом. Авторы определили, что выделенный белок является S-сульфурированным. Картирование и масс-спектрометрический анализ полученного проинсулина, очищенного ионнообменной хроматографией на анионите и ОФ (обращеннофазовой) ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографией), показали наличие дисульфидных мостиков, соответствующих дисульфидным мостикам нативного проинсулина человека. Также сообщается о разработке нового, усовершенствованного способа получения инсулина человека методами генной инженерии в прокариотических клетках. Авторами установлено, что полученный инсулин по своему строению и биологической активности идентичен гормону, выделенному из поджелудочной железы[5].

В последнее время пристальное внимание уделяется упрощению процедуры получения рекомбинантного инсулина методами генной инженерии. Так получили слитой белок, состоящий из лидерного пептида интерлейкина присоединенного к N-концу проинсулина, через остаток лизина. Белок эффективно экспрессировался и локализовался в тельцах включения. После выделения белок расщеплялся трипсином с получением инсулина и С-пептида. Другая группа исследователей действовала аналогичным способом. Слитой белок, состоящий из проинсулина и двух синтетических доменов белка А стафилококков, связывающих IgG, локализовался в тельцах включения, но обладал более высоким уровнем экспрессии. Белок выделялся аффинной хроматографией с использованием IgG и обрабатывался трипсином и карбоксипептидазой В. Полученные инсулин и С-пептид очищались ОФ ВЭЖХ. При создании слитых конструкций весьма существенным является соотношение масс белка носителя и целевого полипептида. Так описано конструирование слитых конструкций, где в качестве полипептида - носителя использовали белок, связывающий сывороточный альбумин человека. К нему присоединяли один, три и семь С-пептидов. С-пептиды соединялись по принципу "голова-хвост" с помощью аминокислотных спейсеров, несущих сайт рестрикции Sfi I и два остатка аргинина в начале и в конце спейсера для последующего расщепления белка трипсином. ВЭЖХ продуктов расщепления показала, что отщепление С-пептида проходит количественно, а это позволяет использовать способ мультимерных синтетических генов для получения целевых полипептидов в промышленном масштабе.

Получение мутанта проинсулина, который содержал замену Arg32Tyr. При совместном расщеплении этого белка трипсином и карбоксипептидазой В образовывался нативный инсулин и С-пептид содержащий остаток тирозина. Последний, после мечения 125I, активно используется в радиоиммунном анализе[6].

Производство инсулина - многостадийный процесс, включающий:

1) подготовку отрезка (вектора) ДНК, кодирующей молекулу инсулина;

2) выбор клеток, в ДНК которых будет интегрирован отрезок. Обычно это бактерии ( Escherichia coli ) или грибы ( Saccharomyces cerevisiae или Pichia pastoris );

4) отбор клеток и выделение клеточной линии, содержащих рекомбинантную ДНК;

5) культивирование клеток в питательной среде, в которой нарабатываются продукты их жизнедеятельности, в том числе инсулин, закодированный векторной ДНК;

6) извлечение и очистку продукта от С-пептида (при использовании E. coli );

7) формирование вторичной структуры инсулина путем образования дисульфидных мостиков и отщепления ненужных аминокислотных последовательностей (при использовании E. coli ,

при использовании грибов белок секретируется в питательную среду уже сформированным в нужную пространственную структуру);

8) очистку и концентрацию с использованием кристаллизации и хроматографии, лиофилизацию, изготовление лекарственной формы.

Инсулин, как и любой биопрепарат, может вызывать реакцию иммунной системы. Среди возможных причин выделяют измененную структуру белка действующего вещества и наличие примесей (например, фрагментов клеток-продуцентов или продуктов реакции с вспомогательными веществами).

Иммунная реакция может проявляться по-разному –

от выработки антител, не снижающих эффективность терапии,
до полной нейтрализации и инактивации инсулина антителами.

Есть предположение, что основная причина выработки антител на рекомбинантный человеческий инсулин – его способность к агрегации в мультимеры. Агрегаты усиливают иммуногенность экзогенного инсулина, изменяя толерантность В-лимфоцитов, так как похожи на бактериальные антигены и вызывают образование специфических антител

Последние эксперименты на двух линиях клеток рака молочной железы человека (MCF-7), в различной степени экспрессирующих рецептор ИФР-1 и инсулиновый рецептор, показали, что пролиферативный и онкогенный потенциал гларгина не отличается от потенциала инсулина человека.

Вещества, добавляемые к инсулину

Добавки к инсулину вносят для:

а) удлинения действия инсулина и кристаллизации,

в) придания препарату буферных свойств (таблица 1).

Таблица 1. Характеристики коммерческих препаратов инсулина (адаптировано по International Textbook on Diabetes, 1997)

НПХ-инсулин (синонимы — нейтральный протамин Хагедорна, NPH, изофан-инсулин, протамин-инсулин) содержит инсулин и протамин в изофанных, то есть равных, количествах, при которых нет избытка ни инсулина, ни протамина.

Протамин — белок со щелочными свойствами, который получают из рыбьих молок. Нейтральный рН препарата обеспечивается добавлением фосфатного буфера.

Чтобы протамин мог образовывать кристаллы инсулина, добавляют небольшое количество цинка, фенола и/или крезола.

Несмотря на то, что инсулин вызывает множество эффектов в различных тканях человеческого тела, его основным эффектом является стимулирование перехода глюкозы из крови внутрь клеток, что приводит к снижению концентрации глюкозы в крови.

Другими эффектами инсулина являются стимулирование синтеза в печены и мышцах гликогена из глюкозы, увеличение создания жиров и белков, подавление активности ферментов, разрушающих жиры и белки. Таким образом, инсулин обладает анаболическим действием, поскольку усиливает образование жиров и белков, одновременно замедляя их распад.

Основной эффект инсулина заключается в усилении переноса глюкозы через клеточную мембрану внутрь клетки. Других гормонов, снижающих уровень глюкозы крови, в организме человека не существует. Основные эффекты инсулина проявляются в мышцах и жировой ткани, поэтому эти ткани называют инсулинозависимыми. Уровень глюкозы крови снижается при воздействии инсулина и повышается при воздействии т.н. гипергликемических гормонов (глюкагона, соматотропного гормона, глюкокортикоидов).

Дополнительными эффектами инсулина являются увеличение интенсивности образования гликогена, уменьшение образования глюкозы в печени, усиление поглощения клетками аминокислот, необходимых для синтеза белка. Одновременно инсулин уменьшает разрушение белков и жиров. Таким образом, общий эффект инсулина является анаболическим – направленным на формирование жировой и мышечной ткани.

Строение инсулина

Инсулин является полипептидным гормоном, состоящим из двух аминокислотных цепей: А- и В-цепи. Полипептидные цепи соединяются дисульфидными мостиками. Человеческий инсулин по структуре близок к свиному и бычьему, хотя и отличается от них одним и тремя аминокислотными остатками соответственно.

Открытие инсулина

Островки поджелудочной железы были открыты в 1869 году Паулем Лангергансом при микроскопическом исследовании структуры поджелудочной железы. В 1889 году Оскар Малиновски в Германии при удалении поджелудочной железы у собаки вызвал у нее симптомы сахарного диабета. В 1921 году Ф. Бантинг и Ч. Бест выделили из клеток островков поджелудочной железы инсулин, а Д. Коллип разработал методику его очистки.

В 1922 году инсулин впервые был введен пациенту, страдающему сахарным диабетом. Его лечебное действие показало, что такой вид терапии является наиболее эффективным. В последующие годы основные усилия ученых были направлены на организацию производства в больших количествах. В 1923 году была вручена Нобелевская премия за открытие и выделение инсулина. В последующем аминокислотная структура инсулина была полностью расшифрована Ф. Сенгером.

Синтез инсулина

В островковых клетках поджелудочной железы инсулин синтезируется в несколько этапов. На первом этапе происходит синтез молекулы предшественника инсулина – препроинсулина. На втором этапе от молекулы препроинсулина отделяется сигнальный пептид, после чего образуется проинсулин. После созревания происходит образование окончательной молекулы инсулина. На этапе созревания от молекулы проинсулина отделяется С-пептид, который не оказывает биологического действия. После отделения С-пептида формируется активная форма инсулина.

Выделение инсулина в кровь происходит при повышении уровня глюкозы в крови. Дополнительно регуляция выработки инсулина производится автономной нервной системы. Разрушение инсулина происходит в печени и почках при воздействии фермента инсулиназы.

Препараты инсулина

В настоящее время фармацевтическая промышленность производит значительное число препаратов инсулина, имеющих различные биологические эффекты. Выделяют человеческий, свиной инсулины, инсулин крупного рогатого скота. По степени очистки различают традиционные, монопиковые, монокомпонентные инсулины. По времени действия выделяют инсулины короткого и пролонгированного действия. Последние делятся на инсулины среднего, длительного и сверхдлительного срока действия. Есть также инсулины ультракороткого и депо-инсулины, выделяющиеся медленно из подкожной клетчатки.

Подбор схемы инсулинотерапии – сложное и очень ответственное мероприятие. От правильности выбора формы инсулина и схемы его дозирования зависит успешность достижения компенсации сахарного диабета и, как следствие, качество жизни пациента.

Типы сахарного диабета

В настоящее время выделяется два основных типа сахарного диабета, различающиеся по причине и механизму появления, а также по принципам лечения

Сахарный диабет 1 типа

Сахарный диабет 1 типа - заболевание эндокринной системы, для которого характерным признаком является повышенная концентрация глюкозы в крови, которое развивается из-за деструктивных процессов в специфических клетках поджелудочной железы, секретирующих гормон - инсулин, вследствие чего наблюдается абсолютный недостаток инсулина в организме

Сахарный диабет 2 типа

Сахарный диабет 2 типа - одна из разновидностей сахарного диабета - заболевания обмена веществ, возникающего в результате пониженной чувствительности клеток к инсулину, а также относительной недостачи инсулина в организме

Гестационный сахарный диабет при беременности

Гестационный сахарный диабет может развиваться при беременности (примерно в 4% случаев). В его основе лежит снижение способности по усвоению глюкозы

Гипогликемия

Гипогликемией называют патологическое состояние, характеризующееся снижением концентрации глюкозы в плазме крови ниже уровня 2,8 ммоль/л, протекающее с определенной клинической симптоматикой, либо менее 2,2 ммоль/л независимо от наличия или отсутствия клинических признаков

Кома при сахарном диабете

Информация о наиболее опасном осложнении сахарного диабета, требующем экстренной медицинской помощи,- коме. Описываются виды ком при сахарном диабете, их специфические признаки, тактика лечения

Синдром диабетической стопы

Синдром диабетической стопы - одно из осложнений сахарного диабета, наряду с диабетической офтальмопатией, нефропатией и др., представляющее собой патологическое состояние, возникшее вследствие поражения периферической нервной системы, артериального и микроциркуляторного русла, проявляющееся гнойно-некротическими, язвенными процессами и повреждением костей и суставов стопы

О диабете

Сахарный диабет — термин, объединяющий эндокринные заболеваний, характерной чертой которых является недостаточность действия гормона инсулина. Главным симптомом сахарного диабета является развитие гипергликемии – увеличения концентрации глюкозы в крови, имеющее стойкий характер

Симптомы диабета

Эффективность лечения сахарного диабета напрямую зависит от времени выявления этого заболевания. При сахарном диабете 2 типа заболевание может длительное время вызывать лишь незначительно выраженные жалобы, на которые пациент может не обращать внимания. Симптомы диабета могут быть стертыми, что затрудняет диагностику. Чем раньше поставлен правильный диагноз и начато лечение, тем меньше риск развития осложнений сахарного диабета

Анализы в СПб

Одним из важнейших этапов диагностического процесса является выполнение лабораторных анализов. Чаще всего пациентам приходится выполнять анализ крови и анализ мочи, однако нередко объектом лабораторного исследования являются и другие биологические материалы.

Консультация эндокринолога

Специалисты Северо-Западного центра эндокринологии проводят диагностику и лечение заболеваний органов эндокринной системы. Эндокринологи центра в своей работе базируются на рекомендациях Европейской ассоциации эндокринологов и Американской ассоциации клинических эндокринологов. Современные диагностические и лечебные технологии обеспечивают оптимальный результат лечения.

Анализ на гликогемоглобин

Гликогемоглобин (гликированный гемоглобин, гликозилированный гемоглобин, гемоглобин А1с) – соединение гемоглобина с глюкозой, образующееся в эритроцитах

Диагностика и лечение гинекологических заболеваний, консультирование семейных пар по вопросам лечения бесплодия ЭндокринологДиагностика и лечение сахарного диабета, ожирения, остеопороза Хирург-эндокринологДиагностика и лечение заболеваний щитовидной железы, околощитовидных желез, надпочечников Диетолог-эндокринологЛечение ожирения, диагностика эндокринных причин ожирения, комплексные программы снижения веса Андролог Помощь в решении мужских проблем: бесплодия, нарушения потенции, воспалительных заболеваний Детский эндокринологДиагностика и лечение эндокринных заболеваний у детей до 18 лет МаммологДиагностика и лечение заболеваний молочных желез

Отзывы

Истории пациентов
Видеоотзывы: опыт обращения в Северо-Западный центр эндокринологии

Услуги

Экспертное УЗИ щитовидной железы
УЗИ щитовидной железы выполняется хирургами-эндокринологами с использованием аппаратов экспертного класса

Денситометрия: ультразвуковая
Денситометрия (определение плотности костной ткани) - без облучения, выполняется эндокринологом

Гормоны щитовидной железы
Всё о сдаче анализа на гормоны щитовидной железы: какие гормоны существуют, как сдавать гормоны, где сдавать анализ на гормоны

Удаление щитовидной железы
Информация об удалении щитовидной железы в Северо-Западном центре эндокринологии

Сотрудничество с центром

Возможности сотрудничества
Варианты и обсуждение вопросов сотрудничества с Северо-Западным центром эндокринологии

Специалисты Центра эндокринологии регулярно участвуют в международных конгрессах, стажировках, обучающих семинарах. За 3 года специалистами центра получено 15 патентов РФ на изобретения

Трехостановочный маршрут

Первая остановка — научно-исследовательский центр, в котором разрабатывают штаммы-продуценты (то есть те, из которых затем будут получать органические вещества), технологию производства субстанций и лекарственных препаратов. Также в Стрельне проводят стандартизацию препаратов, все необходимые исследования, а далее формируют пакет документов для регистрации.

Технология основана на генно-модифицированной бактерии кишечной палочки. При разработке лекарства в бактерию встраивают чужеродную ДНК, в составе которой есть ген, отвечающий за синтез белка проинсулина.

Банк клеток — основа производственного процесса компании. Определенные виды инсулина основаны на разных штаммах-продуцентах, посевная культура каждого из них хранится в пробирках объемом 1 мл в морозильных камерах при температуре -70 °С и ниже. Культуру ежегодно проверяют на продуктивность, жизнеспособность и прочие важные показатели качества.

На завод в Пушкин передают главную посевную культуру, которая хранится в особых условиях, и из нее готовят уже рабочую посевную культуру, которая также хранится в пробирках в сейфах. Производят инсулин в два этапа. Первый — биосинтез, где из 1 мл рабочей культуры должно вырасти множество клеток, внутри которых синтезируется инсулин. Вторая часть — очистка, где из клеток необходимо достать инсулин и освободить его от примесей. Высокоочищенный инсулин в виде порошка передается на предприятие в город Оболенск Московской области, где его превращают в раствор, а далее в готовый лекарственный препарат для пациента.

Из трех остановок наша команда выбрала вторую и отправилась на завод в Пушкин. Чтобы в России инсулина хватало всем нуждающимся пациентам, требуется производить 800–850 кг субстанции в год. Расчетная мощность завода ГЕРОФАРМ — 1 000 кг.

От 1 мл до 3 000 л

Бактерия в реакторах объемом 200 л потребляет растительные пептоны, глюкозу, аминный азот, кислород и прочие микроэлементы, важные для эффективного роста и размножения. Дальше все это подается в сборник, откуда идет подпитка основного ферментера. Из 1 мл клеток менее чем за сутки получается около 3 000 л культуральной жидкости, где клетки сами внутри себя начинают производить инсулин. Сначала готовится подпитка на одну серию, параллельно другое оборудование очищается, начинается подготовка к следующей серии. В результате работа ведется непрерывно.

Клетки-матрешки

На следующем этапе необходимо достать инсулин из клеток. Они устроены по принципу матрешки. Первый слой — стенка бактерий. Внутри нее — тельца включения, а уже в них гибридный белок с инсулином. Нужно разорвать наружный слой, достать инсулин и очистить его.

В итоге биосинтеза получается паста телец включения. Это устойчивый, содержащий инсулин продукт, который хранится в морозильных камерах, а затем используется на стадии очистки. Все, что осталось от клетки, отправляется в килл-танки, где биологический отход дезактивируется. После взятия пробы отходы попадают на очистные сооружения.

Из пасты в порошок

4 584 575*
численность пациентов с сахарным диабетом в России на 1.01.2019
*эта цифра постоянно растет

В соседнем помещении Иван Анатольевич показывает, как паста телец включения с белком инсулина передается на очистку. Первая ее стадия — ренатурация и концентрирование.

Когда клетка синтезирует чужеродный белок, он представляет собой третичную структуру, свернутую неправильными связями. Поэтому необходимо растворить пасту телец включения в одном маленьком реакторе в воде, затем передать в одну из ренатурационных бочек, куда добавляют ферменты, которые разрезают этот белок, разворачивают его, затем другие ферменты сшивают его как надо. В результате получается правильно свернутый белок.

Далее полупродукт фильтруется и проходит несколько стадий очистки. На первой из них избавляются от крупных посторонних веществ, например липополисахаридов, по принципу разности зарядов. На следующей стадии отделяются близкородственные примеси и получается инсулин с 99-процентной чистотой. На стадии растворения и кристаллизации, часть примесей также извлекается. Далее фильтруют, сушат и получают кристаллический порошок. Он хранится в морозильных камерах при температуре -20 °С. В таком виде он передается на завод в Оболенске, где его растворяют и заполняют по флаконам, картриджам и шприц-ручкам.

Читайте также: